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骨肉瘤是最常见、恶性程度最高的骨肿瘤,多药耐药现象常有发生。鉴于目前关于骨肉瘤多药耐药的研究欠缺,因此需要模拟临床用药,建立骨肉瘤耐药细胞系来研究其生物学特性及耐药机制的改变。由于实体肿瘤常常由不同的细胞亚群的亚克隆构成,具有肿瘤异质性,在细胞水平上不同的耐药机制可能参与其中。因此我们通过将人骨肉瘤细胞系MG63培养在含长春新碱(VCR)浓度梯度增高的培养液中,建立了四株耐药指数逐渐增高的骨肉瘤MG63/VCR耐药亚系,分别命名为MG63/VCR1,MG63/VCR2,MG63/VCR3,MG63/VCR4。通过CCK8实验测定了他们的耐药指数,耐药衍生系相比于亲本MG63对长春新碱的耐药指数分别达163,476,1247,2707倍。并且对DOX,THP,PTX交叉耐药。随着耐药指数的增加,细胞的某些生物学特性表现出渐进性的变化。应用倒置显微镜观察细胞形态差异,发现耐药细胞亚系有着长梭形的形态,细胞两极的突起明显增长。细胞的增殖能力检测实验发现耐药细胞的增殖能力与耐药指数呈负相关,这反映在CCK8增殖实验,也反映在平板克隆实验形成的克隆体积上,以及细胞周期检测结果中。但是细胞的迁移能力及某些耐药相关基因的表达却不是随着耐药程度的增加而线性变化:我们用RT-PCR,实时定量PCR检测了五种细胞中MDR1,MRP1,Topo-II,LIMK1,GST-π等在基因表达上的差异。MDR1和MRP1的表达在耐药细胞中显著高于亲本MG63。但高度耐药的MG63/VCR3及MG63/VCR4细胞中,MRP1的表达量反而低于中度耐药的MG63/VCR2,这个趋势与TOPO-II,LIMK1一致,后者被认为与细胞的运动能力、迁移等密切相关。此外GST-π的表达没有差异。通过检测胞内多柔比星(DOX)的聚积评价耐药细胞的外排功能,结果显示:随耐药程度增加,胞内荧光强度逐渐降低,但加入钙离子通道阻滞剂维拉帕米后,胞内DOX又都有显著增强。上述结果提示,肿瘤细胞耐药程度不同,其耐药机制可能也在发生变化。综合细胞的形态等变化,我们认为瘤内克隆和表型的异质性改变是其根本原因。综上所述,MG63/VCR差异耐药细胞系的建立是评估人骨肉瘤耐药的生物学特性改变及机制、筛选新的耐药相关基因的非常重要的工具。同时为临床上攻克肿瘤多药耐药提供了更加全面、完善的实验依据。