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目的利用体外培养人支气管上皮细胞（BEAS-2B）,观察并比较两种空气颗粒物烟草烟雾冷凝物（cigarette smoke condensate,CSC）和天津市大气细颗粒物(fine particulate matter,PM2.5)对BEAS-2B细胞的毒性效应,揭示相关毒作用机制,为预防和控制两种典型空气颗粒物所致呼吸系统疾病提供科学基础。方法1.两种颗粒物染毒液的制备和处理:CSC:选用3R4F参比卷烟为样品。按GB/T5606.1-2004的规定取样,捕集烟草烟雾冷凝物并调整浓度得10mg/ml的CSC样品母液,-80℃保存备用。PM2.5:利用崂山2030型中流量智能TSP采样器的第三级采集细颗粒物,随后进行超声洗脱处理,制成细颗粒物干粉,配成终浓度为100mg/ml的细颗粒物母液,-80℃保存备用。2.利用CCK-8法检测不同浓度颗粒物对BEAS-2B细胞存活率的影响,明确CSC和PM2.5的半数抑制浓度并确定后续实验的干预剂量;利用倒置显微镜观察两种颗粒物对BEAS-2B细胞形态的影响;采用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒,利用流式细胞仪分析两种颗粒物对细胞凋亡的影响。3.利用酶联免疫（ELISA）法检测颗粒物暴露后BEAS-2B细胞裂解液中MDA含量、GSH、8-OHd G表达水平以及细胞培养上清中SOD水平,明确颗粒物暴露导致的细胞氧化应激反应;利用酶联免疫（ELISA）法检测颗粒物暴露后BEAS-2B细胞培养液中IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8的含量,明确颗粒物暴露导致的炎症反应。4.利用定制的凋亡抗体芯片Ray Bio?Human Apoptosis Antibody Array G1高通量筛选CSC和PM2.5诱导BEAS-2B细胞凋亡时涉及的凋亡蛋白,并利用RT-PCR和Western blotting方法对差异的凋亡蛋白及其所在通路蛋白进行验证。5.利用定制的炎症抗体芯片Ray Bio?Human Inflammation Antibody Array G Series III筛选PM2.5暴露导致BEAS-2B细胞中炎症因子表达的变化,并利用ELISA方法对差异炎症因子及其所在通路进行验证。结果1、CSC和PM2.5的成分分析。CSC中共检测出13种多环芳烃类有机物,含量由多到少依次为:蒽（18.99%）、苯并蒽（11.57%）、苯并k荧蒽（8.52%）、苯并b荧蒽（8.29%）、屈（8.17%）、菲（6.97%）、苯并苝（6.83%）、茚并芘（5.13%）、芘（3.57%）、二苯并蒽（3.53%）、荧蒽（3.23%）、芴（2.13%）、苯并芘（0.81%）;另外检出5种重金属类物质,含量由多到少依次为:Zn（8.86%）、Cu（2.65%）、Cd（0.44%）、Mn（0.22%）、Hg（0.09%）。PM2.5中共检测出11种多环芳烃类有机物,含量由多到少依次为:苯并b荧蒽（6.50%）、苯并k荧蒽（5.62%）、屈（4.71%）、苯并芘（4.53%）、苯并苝（4..05%）、苯并蒽（3.92%）、荧蒽（3.87%）、茚并芘（3.21%）、芘（2.82%）、菲（0.69%）、蒽（0.26%）;另外检出8种重金属类物质,含量由多到少依次为:Zn（28.95%）、Pb（11.47%）、Mn（9.80%）、Cu（9.29%）、Cr（0.13%）、Ni（0.13%）、Cd（0.06%）、Hg（0.002%）。2、CSC和PM2.5对BEAS-2B细胞的毒性效应。（1）根据CCK-8实验结果得出CSC对BEAS-2B细胞的半数抑制浓度（IC50）约为80μg/ml,即设置CSC染毒剂量为（0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml）;PM2.5对BEAS-2B细胞的半数抑制浓度（IC50）约为165μg/ml,因此设置PM2.5染毒剂量为（0μg/ml、17.5μg/ml、35μg/ml、70μg/ml）。（2）BEAS-2B细胞经CSC暴露24h,可见细胞发生形态学改变。与对照组相比,细胞胞浆疏松,触角变狭长,彼此连接减少,细胞整体变细长瘦弱,透明度下降,并有不同程度的死亡细胞。而PM2.5暴露后,BEAS-2B细胞形态的改变是细胞之间空隙加大,生长密度降低,漂浮细胞增多。随着PM2.5浓度的增加,晃动培养液,漂浮细胞增多,并且可以观察到细胞中存在颗粒状物质。（3）BEAS-2B细胞经CSC处理24h后,在AnnexinⅤ-FITC/PI散点图上可见随着CSC浓度的增加,位于右下和右上象限的早凋和晚凋细胞逐渐增多,且与对照组相比,BEAS-2B细胞的凋亡率显著高于对照组;而BEAS-2B细胞经PM2.5处理24h后,在AnnexinⅤ-FITC/PI散点图上可见随着PM2.5浓度的增加,位于左上和右上象限的细胞膜破损和晚凋细胞逐渐增多,且与对照组相比,BEAS-2B细胞的凋亡率显著高于对照组。（4）BEAS-2B细胞在CSC的刺激下,各处理组EC-SOD、MDA、8-OHd G水平显著高于对照组,而GSH水平显著低于对照组,结果表明CSC可通过氧化应激方式对BEAS-2B细胞造成毒性损伤;而BEAS-2B细胞在PM2.5的刺激下,中、低剂量组的EC-SOD、MDA、8-OHd G水平升高缓慢,但在高剂量组则极显著高于对照组,而GSH水平显著低于对照组,结果表明PM2.5可导致BEAS-2B细胞发生氧化应激反应并不明显。（5）BEAS-2B细胞在CSC的刺激下,各处理组TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-8水平显著高于对照组,结果显示CSC可导致细胞发生炎症反应;而BEAS-2B细胞在PM2.5的刺激下,各处理组TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-8水平极显著高于对照组,结果显示PM2.5可导致细胞免疫炎症水平升高,释放大量炎性介质,从而造成细胞损伤。3、CSC和PM2.5引起BEAS-2B细胞凋亡的机制（1）CSC蛋白芯片及Western blotting实验结果显示BEAS-2B细胞相关凋亡蛋白TNF-R1、p21、IGF-1R、PI3K、AKT表达水平显著升高,Fas L表达水平显著降低,由此我们推测IGF-1R/PI3K/AKT通路可能是引发CSC暴露BEAS-2B细胞发生恶性转化并死亡的作用机制。（2）PM2.5凋亡抗体芯片、RT-PCR和Western blotting实验结果均显示BEAS-2B细胞在PM2.5的刺激下,相关凋亡蛋白TNF-R1、Fas、HTRA、BID、Caspase8表达水平显著升高,IGF-2、TNF-R2表达水平显著降低。4.PM2.5引起BEAS-2B细胞炎症反应的机制PM2.5芯片结果显示炎症因子IL-8、IL-13、TNF-α、GM-CSF、IL-2、IL-17、TGF-b1、IP-10、I-309、IL-4、EOTAXIN、IL-3、EOTAXIN-2表达升高,炎症因子TIMP-2、IL-10表达降低。利用KEGG数据库和ELISA方法验证结果显示IL-4、IL-13、Eotaxin、TNF-α、IL-3等相关炎症因子的表达升高激活哮喘相关通路最终导致BEAS-2B细胞发生炎症反应引起支气管损伤。结论1、CSC和PM2.5在所包含的物质成分及各成分含量上均存在差异。在多环芳烃类物质方面:CSC中主要检出13种多环芳烃类物质,含量占前三位的分别是:蒽、苯并蒽、苯并k荧蒽,而PM2.5中主要检测出11种多环芳烃类物质,含量占前三位的分别是:苯并b荧蒽、苯并k荧蒽、屈。在重金属类物质方面:CSC中主要检出5种重金属类物质,含量占前三位的分别是:Zn、Cu、Cr,而PM2.5中主要检出8种重金属类物质,含量占前三位的分别是:Zn、Pb、Mn。2、CSC和PM2.5对BEAS-2B细胞的毒性效应存在差异。CSC对BEAS-2B细胞的半数抑制浓度（IC50）约为80μg/ml,PM2.5对BEAS-2B细胞的半数抑制浓度（IC50）约为165μg/ml,可见CSC对BEAS-2B细胞的毒性大于PM2.5;CSC导致BEAS-2B细胞变狭长瘦弱,PM2.5则可导致细胞回缩变形并且可在细胞中观察到颗粒状物质,可见CSC导致BEAS-2B发生形态学变化与PM2.5存在差异;CSC和PM2.5均可诱导BEAS-2B细胞的氧化应激和炎症反应,而CSC致BEAS-2B细胞发生氧化应激反应水平显著高于PM2.5,PM2.5则主要是通过炎症反应作用于BEAS-2B细胞。3、CSC和PM2.5诱导BEAS-2B细胞凋亡机制不同。CSC可以通过TNF-R1、p21、IGF-1R的表达升高引发BEAS-2B细胞凋亡,并通过促进IGF-1R表达升高激活下游PI3K及AKT蛋白导致BEAS-2B细胞的恶性转化及凋亡。而PM2.5则通过TNF-R1、Fas、BID、Caspase8、HTRA的表达升高来影响BEAS-2B细胞凋亡。4、PM2.5可以通过IL-4、IL-13、Eotaxin、TNF-α、IL-3等相关炎症因子的表达升高激活哮喘相关通路最终导致BEAS-2B细胞发生炎症反应引起支气管损伤。