系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus,SLE),慢性炎症的自身免疫紊乱,是一种由免疫复合物沉积以及后续导致严重组织损伤的炎症为主要特征的潜在致命性疾病。由于高发病率和致死率,狼疮肾炎(1upus nephritis, LN)是一种最严重的组织损伤。LN在SLE疾病早期的发病率是50%,而且在SLE发病晚期的发病率是60%。近年来,LN的十年的幸存率是68%-98.2%。因此,LN发病机制的研究对于开发LN靶向性治疗是非常重要的。目前,对于LN的发病机制已经有一些进展。免疫复合物在肾小球的沉积使其释放出引起炎症的促炎性细胞因子以及趋化因子,从而诱导单核细胞和多型核粒细胞的趋化,后续的蛋白酶的释放使得内皮损伤以及系膜增生。免疫复合物的沉积也促进了适应性免疫应答以及一型干扰素的释放,从而进一步活化巨噬细胞,使其释放更多的促炎细胞因子,导致肾小球上皮性增生和纤维化。但是,调控LN发病的分子机制到目前还不太清楚,从而阻碍了研究LN有效治疗方法的脚步。最近一些研究指出,一些在自身免疫性疾病以及炎症疾病中报导的多功能蛋白有可能参与了LN的发病。其中,GRN备受关注。GRN是一种高度糖基化的自分泌生长因子,在上皮细胞,某些神经元细胞以及巨噬细胞中高表达。GRN早先被发现的功能是调控细胞生长、发育以及组织重构。作为多功能的蛋白,GRN也参与多种生理和病理的过程,包括炎症、伤口愈合以及固有免疫的调控。最近的研究发现GRN同自身免疫病相关,包括类风湿性关节炎、多发性硬化症以及二型糖尿病。而且已经有一项研究指出GRN同SLE疾病活动性密切相关,但是,GRN是否参与LN的发病目前尚不清楚。我们实验室前期的研究发现,活化的淋巴细胞来源的DNA (ALD-DNA)在BALB/c小鼠中可以诱导SLE综合征,并表现出LN这一症状。该狼疮小鼠模型表现出与人类SLE相似的症状,同其他模型相比没有遗传背景的干扰,所以该模型是探索LN发病机制的一个非常好的工具。已有大量文献报道,M2b型极化的细胞在狼疮肾炎的发病以发展过程中发挥至关重要的作用。而且在前期研究过程中我们发现,ALD-DNA诱导的肾脏巨噬细胞向M2b型的极化在LN发病中扮演非常重要的角色。但是,ALD-DNA诱导巨噬细胞极化的机制研究的还不够充分。基于我们前期的研究以及国内外相关研究现状,我们推测GRN参与LN的发病,而GRN调控LN的发病是通过GRN对ALD-DNA诱导的巨噬细胞的极化的影响来实现的。本课题旨在探讨GRN在LN发病过程中所发挥的作用及其机制,并进一步研究GRN调控LN的发病是通过影响ALD-DNA诱导的巨噬细胞的极化来实现的,以期为LN的防治提供新的理论基础和实验依据。第一部分GRN与LN疾病严重程度的相关性分析为了研究GRN在SLE小鼠模型中的表达水平,我们首先按照以前报道的步骤建立SLE小鼠模型,并观察到血清高水平抗dsDNA抗体、肾脏免疫复合物沉积、肾小球肾炎以及蛋白尿。我们利用ELISA的方法每两周检测一次小鼠模型血清中的GRN,发现在模型建立的第四周,同对照组的小鼠相比,在小鼠模型中血清的GRN非常明显的上调。Pearson相关性分析显示,血清中的GRN水平同小鼠肾脏病理评分呈正相关。为了进一步研究GRN水平与LN疾病严重程度的相关性,我们进一步分析血清中GRN水平与尿蛋白水平的相关性发现,血清中GRN水平与尿蛋白水平也是正相关。以上结果表明,在SLE小鼠模型中,GRN水平与LN疾病严重程度呈正相关,并提示,GRN在ALD-DNA诱导的LN的发病的过程中具有重要作用。第二部分GRN在LN发病中的作用为了验证GRN是否参与ALD-DNA诱导的LN的发病过程,我们首先利用肌肉注射pcDNA3.1-GIN的方法上调GRN在小鼠体内的表达,然后在背部皮下注射ALD-DNA建立SLE小鼠模型。结果发现,GRN过表达组的模型小鼠血清中GRN水平明显上调。为研究GRN过表达对LN发病的影响,我们分析了GRN过表达组和对照组小鼠的肾脏病理切片并进行评分,发现GRN过表达组的肾脏病理评分明显高于对照组,与此同时,GRN过表达组的尿蛋白水平也远远高于对照组。此外,我们还检测了小鼠血清中肌酐的水平,发现GRN过表达组中的血清肌酐明显上调。以上结果表明,GRN过表达加重了ALD-DNA诱导的LN的发病。然后我们利用尾静脉注射编码GRN的shRNA的慢病毒颗粒的方法在体内下调GRN的表达水平,并在此基础上建立SLE小鼠模型。首先我们进行下调效率的验证,ELISA检测血清GRN水平的结果显示该方法有效地下调了小鼠体内GRN的表达。为了研究GRN表达水平的下调对ALD-DNA诱导的LN发病的影响,我们分析了GRN表达下调组和对照组小鼠的肾脏病理切片并进行评分,发现GRN表达下调组的肾脏病理评分明显低于对照组,与此同时,GRN表达下调组的尿蛋白水平也远远低于对照组。而且,GRN表达的下调可以降低小鼠血清中的肌酐的水平。以上结果表明,GRN表达下调减轻了ALD-DNA诱导的LN的发病。综上所述,GRN参与了ALD-DNA诱导的LN的发病。第三部分GRN调控LN发病的机制基于我们的前期研究以及国内外相关研究的现状,我们推测GRN调控LN的发病是通过GRN对ALD-DNA诱导的巨噬细胞朝M2b方向极化的调控来实现的。为了研究GRN对于ALD-DNA诱导的巨噬细胞的极化的调控,我们首先制备各个实验组以及对照组的小鼠的肾脏单个核细胞悬液,并利用流式细胞术分选出了CD1lb+/F4/80+肾脏巨噬细胞,然后利用实时荧光定量PCR的方法检测巨噬细胞极化指标的基因表达情况,包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、MCP-1、 Nos2(iNOS)和Argl的mRNA水平。结果发现,GRN过表达组的SLE小鼠的肾脏巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、MCP-1、Nos2(iNOS)的mRNA水平比对照组明显升高,而GRN表达下调组的SLE小鼠肾脏巨噬细胞的TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12、MCP-1和Nos2(iNOS)的mRNA水平比对照组明显下降,而且无论GRN上调还是下调,Arg1的表达水平没有差异性的变化。以上结果显示,GRN是通过影响ALD-DNA诱导的巨噬细胞的M2b极化来调控LN的发病。我们研究还发现,ALD-DNA在体外诱导巨噬细胞极化的同时,可以剂量依赖的上调表达GRN的mRNA水平以及蛋白水平。为了进一步研究GRN对于ALD-DNA诱导的巨噬细胞的极化的调控,我们在细胞培养液中加入鼠源重组的GRN,并加入ALD-DNA进行刺激,发现外源GRN的加入可以增强ALD-DNA诱导的巨噬细胞的极化。而在体外利用GRN的抑制剂(Elastase Inhibitor)可以抑制ALD-DNA诱导的巨噬细胞的极化,进一步研究发现,应用siGRN下调GRN的表达也可以明显抑制ALD-DNA诱导的巨噬细胞的极化。而且我们研究还发现MAPK信号通路的激活参与了GRN对ALD-DNA诱导的巨噬细胞极化的调控。本研究在ALD-DNA诱导小鼠SLE综合症的动物模型基础上,发现一种多功能蛋白GRN参与调控ALD-DNA诱导的LN的发病,并证实GRN参与调控ALD-DNA诱导的LN的发病是通过影响ALD-DNA诱导的巨噬细胞的极化来实现的。此外,我们还进一步证实MAPK信号通路参与了GRN对ALD-DNA诱导的巨噬细胞极化的调控。本研究为阐明LN发病的机制提供了新的实验数据和思路,并提供了基于GRN的LN治疗新靶点。