棉花是我国人民衣着、纺织工业的主要原料和出口创汇的重要产品，关系国计民生，意义重大。枯萎病是棉花两种重要病害之一，是一种世界性棉花病害。在我国也有发生并导致棉花的严重减产。由于棉花基因组本身具有的复杂性及该病抗病遗传规律的复杂性，所以一直无法克隆到抗病基因，近年来，随着生物技术的快速发展，尤其是分子标记技术的日趋完善。越来越多的科学家希望利用这些方法来鉴定和分离抗病基因，揭示棉花品种的遗传多样性以及发展新的棉花育种方法。寻找与抗性位点紧密连锁的标记以及分子辅助育种的建立都将加速棉花的抗病育种进程。 目前，不少植物抗病基因被标记定位甚至克隆，在被克隆的已知功能的R基因中存在有特征性的保守结构域，如核苷酸结合位点(nucleotide-bindingsite，NBS)、富含亮氨酸重复(1eucine-richrepeats，LRR)、丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶类似受体(receptor-likeserine/threoninekinases，STK)，以及与果蝇Toll蛋白及哺乳动物白细胞介素-1受体(tollandinterleukin-receptor，TIR)的胞外域相似的区域。这些氨基酸水平上的保守结构域可能与基因的功能有关。根据已克隆基因的保守区设计简并或特异引物，利用PCR技术扩增植物基因组DNA或cDNA，得到的扩增产物经测序和序列对比即可作为抗病基因类似物(resistancegeneanalog，RGA)。与已克隆抗病基因同源性较高的RGAs可作为探针，筛选抗感分离群体，进行抗病基因的分子标记定位，此技术即为RGAP(resistancegeneanalogpolymorphism)标记。 本研究首先从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和其他一些数据库中获取部分已克隆的植物抗病基因的核苷酸序列以及117条棉花的抗病基因同源序列的核苷酸序列。获取其登录号及编码的氨基酸序列。对提供的氨基酸序列利用BLASTp进行分析，寻找其保守区域。对NBS类型的RGAs编码的氨基酸序列利用DNAman进行多重对比分析，并利用NCBI中的BLASTp程序与已克隆的植物抗病基因进行同源性比对，结果显示：1.棉花基因组中也存在大量的抗病基因同源序列，其NBS保守区P-loop结构大多为：GGGVGKTT。Kinase-2结构大多为：LLVLDDV。跨膜区也表现出较强的保守性，氨基酸序列大都为GLPLAL。2.在棉花基因组中存在两种类型的抗病基因，符合在双子叶植物中同时含有TIR-NBS和non-TIR-NBS两种类型的抗病基因。3.已克隆的棉花抗病基因同源序列与已克隆的植物抗病基因具有较大的同源性，证实了利用RGA进行抗病基因克隆的可行性。本研究采用RGAP分子标记技术，通过对抗病品种中12与感病品种军棉一号的抗感杂交分离世代F2群体进行DNA多态性分析，共筛选了11对引物组合，其中F3-R3引物对可在中12抗病亲本和F2代抗病群体中稳定地扩增出一条大小在400bp的DNA多态性片段，在感病亲本中没有扩增到。对特异条带进行了回收克隆测序，测出条带的长度为396bp。生物信息学分析显示，该片断中与Genbank上的抗病基因同源序列具有同源性，用DNAMAN软件翻译后，得到的氨基酸序列含有抗病基因跨膜保守区域GLPL以及NBS结构。根据其序列设计了3对特异性引物，其中S3-AS3对F2群体进行检测时，可扩增一条200bp大小的条带并与抗病位点连锁，可以作为棉花抗枯萎病基因的有效的分子标记。 本文还对陆地棉抗枯萎病遗传规律、RGAP标记技术的可靠性及注意事项进行了探讨，同时对RGAP标记在棉花抗病育种中的应用前景进行了展望。