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副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）是引起猪格拉瑟氏病的病原,一种应激环境条件下侵入体内,导致宿主出现如胸膜炎、腹膜炎、关节炎和脑膜炎为病症的传染病。双组份调节系统（TCS,two-component regulatory system）是细菌产生环境应答并调节基因差异表达的膜应激系统（ESRs,Envelope stress responses）。Cpx双组份系统是副猪嗜血杆菌膜应激系统之一,由组氨酸激酶CpxA和反应调节子CpxR组成。应激环境诱导Cpx系统激活,CpxR通过改变基因的转录水平缓解膜压力。本课题拟通过对副猪嗜血杆菌进入宿主体内面临的环境分析,初步探究副猪嗜血杆菌Cpx系统潜在诱导因子及特定因子激活下Cpx系统调控基因的功能。主要成果如下:1.高渗透压、重金属和抗生素可能是Cpx双组份系统的潜在诱导因子副猪嗜血杆菌定殖猪上呼吸道,感染宿主过程中面临环境不断变化,如温度、渗透压、pH和抗生素等。实验通过模拟副猪嗜血杆菌感染过程中的环境变化,采用荧光定量检测双组份系统基因cpxA和cpxR的转录表达,探索副猪嗜血杆菌Cpx双组份系统基因转录情况。结果发现:副猪嗜血杆菌JS0135 Cpx双组份系统的基因cpxA和cpxR在高渗透压（KCl）,重金属（铜离子、铁离子）和抗生素类（庆大霉素、红霉素）作用下转录上调。如庆大霉素刺激时基因cpxA转录上调7倍,基因cpxR转录上调12倍;铜离子诱导时基因cpxA转录上调10倍,基因cpxR转录上调35倍。表明上述环境因素可能是副猪嗜血杆菌Cpx双组份系统潜在诱导因子。2.铜离子诱导下副猪嗜血杆菌JS0135基因yccA和secY转录上调铜离子刺激下,副猪嗜血杆菌Cpx双组份系统基因转录水平上调极显著,那副猪嗜血杆菌JS0135内膜相关基因的转录情况怎样?我们通过荧光定量检测副猪嗜血杆菌JS0135内膜相关基因转录情况。结果发现:0.5mM Cu2+刺激下,副猪嗜血杆菌JS0135基因yccA转录上调4倍和secY转录上调23倍,差异显著。表明铜离子诱导副猪嗜血杆菌内膜相关基因转录水平上调,基因yccA和secY可能与副猪嗜血杆菌膜铜离子应激有一定作用。3.CpxR蛋白结合基因yccA启动子区域根据以上荧光定量结果,我们推测铜离子刺激下,副猪嗜血杆菌Cpx双组份系统蛋白CpxR可能调控膜铜离子应激相关基因。为验证这个猜测,我们通过荧光定量检测基因cpxR缺失副猪嗜血杆菌内膜相关基因转录情况。同时将CpxR蛋白原核表达纯化后,采取EMSA实验探究蛋白CpxR结合的哪些基因的启动子区域。荧光定量结果:编码通道蛋白tolC转录上调1516倍,差异极显著,基因yccA转录下调0.51倍,差异显著。EMSA实验结果:蛋白CpxR结合编码内膜蛋白的基因yccA启动子区域,推测CpxR蛋白可能调控基因yccA应答庆大霉素的刺激。4.构建基因yccA的缺失和互补菌株,初步探究基因yccA的功能首先,以SH0165全基因组为模板设计引物和扩增PCR,构建重组质粒pK18mobsacB-yccA-UKD,通过自然转化筛选出基因yccA缺失株。在pH6.5,pH7.5和pH8.5的条件下培养JS0135和JS0135ΔyccA,绘制生长曲线,并探究生物被膜形成情况。结果发现缺失基因yccA后JS0135菌株在弱碱条件下生长缓慢,生物被膜形成能力减弱,表明基因yccA对弱碱条件敏感,可能影响细菌生物被膜形成。JS0135和JS0135ΔyccA铜敏感实验发现,JS0135ΔyccA在00.5mM Cu2+环境下生长受到抑制,同时荧光定量实验结果显示基因yccA的转录水平上调显著,表明基因yccA可能跟副猪嗜血杆菌铜耐受作用有关。综上,本研究发现高渗透压、重金属和抗生素可能是Cpx双组份系统的潜在诱导因子,蛋白CpxR调控基因yccA可能跟副猪嗜血杆菌铜耐受作用有关。