2,4-二氯苯酚羟化酶对芳香族化合物的非专一性研究

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随着工业发展的不断进步,人们对于芳香族化合物的需求量不断加大。但是芳香族化合物作为一种污染物质,无论是对生态环境还是对生物的身体健康,都构成了十分严重的威胁。所以迫切需要一种能够高效、友好的处理这些有机污染物的方法。而酶处理法正是这样十分具有优势、且应用前景非常广阔的处理方法。这种方法已经成为了国内外研究开发的一个重点。TfdB-JLU是一种能够转化芳香族化合物的酶。TfdB-JLU在原核大肠杆菌中进行外源表达,操作简便,成本较低。它不仅能够对大多数的芳香族化合物起到转化效果,而且转化效率也较其他酶的效率更高。提高酶处理法效率的第一步就是要得到更多的活性酶,所以首先是通过TfdB-JLU在大肠杆菌中进行外源表达的过程中进行条件优化。TfdB-JLU在大肠杆菌中进行表达的时候,主要是以包涵体的形式存在的,首先筛选得到IPTG浓度为0.2mM时16℃、诱导过夜的条件,能够得到更多可溶性的蛋白。之后利用蛋白裂解液对细胞进行破碎,而非传统的超声破碎,这种优化有利于保持酶的稳定性,从而得到更多的活性蛋白,所得酶的比活力是文献报道中的4.1倍。之后以2,4-二氯苯酚作为底物,筛选得到酶浓度为12μg/ml、25℃、pH7.5、微波功率为480W,0.08mM[EMIM][PF6]和丙酮均能够很好的提高酶活力。在最适条件下,得到了TfdB-JLU对2,4-DCP的Km值为5μM,而Vmax为0.023μM/min。之后研究了TfdB-JLU对底物非专一性。选择了三类污染十分严重且十分具有代表意义的芳香族底物,分别是17种氯酚类、7种联苯类以及12种吲哚杂环类,共39种不同的底物。利用紫外分光光度检测法和高效液相层析法,比较了在不同温度条件下,酶催化不同底物的转化效率以及反应速率,发现TfdB-JLU对所选择的所有氯酚类底物和联苯类底物以及除了3-甲基吲哚以外的所有吲哚类底物,都有一定的活性,只是有些底物的活性相对较小,转化率也较低。并且大部分底物的催化反应都会因为FAD的加入而有所加快,验证了辅酶FAD对绝大多数所选底物转化具有促进作用。为从结构角度深入研究酶促反应,由于没有得到TfdB-JLU的晶体结构,我们根据目的蛋白的氨基酸序列,利用DiscoveryStudio3.5比对并选取同源性较高的模板,进行同源模建。并且将所建模型与所选择的39种芳香族底物利用AutoDock4.2进行分子对接。同时根据模板分析找到辅酶NADPH以及FAD的结合位点,将结合有辅酶的蛋白模型也分别与不同的底物进行分子对接。结果显示加入辅酶NADPH和FAD后反应所需的结合自由能下降,验证了辅酶对催化反应速度的提高作用。而酶对不同底物的研究结果并不理想,不同底物与模型对接所需要的结合自由能相近,与实验中得到的相对活性数据不相符。需要进一步优化模型,提高模型与模板的同源性及各项评分指数。之后利用优化的模型与更多种类的芳香族化合物进行对接,以期对TfdB-JLU的底物非专一性做更深、更广的研究。
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