论文部分内容阅读
目的:检测生物钟蛋白CRY1在胃癌细胞BGC-823、HGC-27细胞系、正常胃黏膜上皮细胞GES-1细胞系中的表达,以及各个细胞系中cAMP含量。通过分子生物学手段改变胃癌细胞系CRY1的表达水平,同时给予cAMP-PKA信号通路的激动剂,检测细胞的增殖、迁移、侵袭的变化,以及第二信使cAMP和相关信号通路蛋白水平的变化,探究CRY1表达量的改变是否会影响cAMP激动剂对胃癌细胞的作用,并阐明CRY1蛋白与cAMP-PKA信号通路之间的相互作用的关系及其对肿瘤细胞生长的影响。方法:(1)培养正常胃黏膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞BGC-823、HGC-27,分别提取细胞的总RNA和总蛋白,通过Real time PCR和Western Blot检测CRY1在不同细胞系中的表达水平。(2)构建CRY1过表达慢病毒载体,感染HGC-27细胞系,使CRY1蛋白过表达。(3)在CRY1表达量不同的细胞系中,摸索异丙肾上腺素的给药浓度和时间,使用CCK-8法检测细胞增殖的变化,并用流式细胞术检测细胞周期的变化,以及用划痕实验和Transwell法去检测细胞迁移、侵袭能力的差异。(4)使用ELISA试剂盒检测各个细胞中的cAMP表达量以及给与ISO刺激后cAMP的表达量。(5)提取细胞总蛋白,通过Western Blot检测相关通路蛋白的表达与修饰情况。(6)通过Pull Down、Co-IP等分子生物学手段检测cAMP-PKA通路中与CRY1相互作用蛋白。结果:(1)胃癌细胞系BGC-823、HGC-27细胞中CRY1的mRNA、蛋白水平均高于胃黏膜上皮细胞GES-1,差异值具有统计学意义(P﹤0.05)。其中胃癌细胞BGC-823的CRY1表达高于的胃癌细胞HGC-27,且差异具有统计学意义。(P﹤0.05)(2)在HGC-27细胞系基础上构建的CRY1过表达细胞中,与未过表达的细胞相比,过表达细胞系中CRY1的mRNA水平比高出近64倍,蛋白水平高出4倍。差异具有统计学意义。(P﹤0.05)(3)过表达CRY1的HGC-27细胞系相对于未过表达的HGC-27细胞系,在高浓度的ISO中增殖、迁移受到的抑制效果较少,其差异值具有统计学意义。(P﹤0.05)(4)构建出原核表达质粒,使用原核表达系统表达并纯化出CRY1-GST蛋白。通过Pull Down实验证明CRY1可与细胞中Gsα亚基相互作用。(5)在293T细胞中过表达CRY1蛋白和Gsα蛋白,通过Co-IP证明细胞中CRY1可与Gsα亚基相互作用。结论:1、胃癌细胞系BGC-823和HGC-27细胞中,CRY1的mRNA和蛋白质的表达量均高于胃黏膜上皮细胞GES-1,且胃癌细胞BGC-823的CRY1表达高于的胃癌细胞HGC-27。2、在CRY1过表达的HGC-27细胞系中,CRY1可以降低cAMP的表达量,并减弱由ISO导致的cAMP升高而对细胞增殖、迁移的抑制。3、CRY1可以和Gsα蛋白相互作用,减弱Gsα蛋白激动腺苷酸环化酶产生cAMP。