论文部分内容阅读
【目的】 鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma，NPC）是源于鼻咽上皮的一种恶性肿瘤，多发于东南亚及我国南方地区，目前认为复发与转移及化疗药物抵抗仍然是NPC患者进行有效治疗面临的重大难题。微小RNA（MicroRNA，miRNA）是一种内源性非编码小RNA，与肿瘤的发生发展密切相关。我们前期对公共芯片数据进行分析，发现miR-296在鼻咽癌组织中低表达。在此基础上，本研究旨在通过体外实验，观察miR-296的表达变化对鼻咽癌细胞侵袭转移能力和化疗药物敏感性的影响，探讨miR-296在鼻咽癌细胞系中的具体作用机理和信号调控途径。 【方法】 （1） 结合公共数据库中鼻咽癌microRNA芯片信息分析、临床鼻咽癌组织标本和实验室鼻咽癌细胞系样品，分析miR-296在鼻咽癌中的表达情况。根据实验设计及miR-296的表达水平确定待研究的鼻咽癌靶细胞株，并优化转染条件。 （2） 通过划痕实验、Transwell小室迁移和侵袭实验，检测miR-296对鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响，并通过Western blotting实验和qRT-PCR实验检测侵袭迁移相关蛋白和基因的表达水平变化。 （3） 通过生长曲线、平板克隆形成实验、Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡和Western blotting实验检测凋亡相关基因蛋白，研究miR-296对鼻咽癌细胞化疗药物敏感性的影响；通过检测罗丹明123外排实验和干性相关基因及蛋白的表达，探讨miR-296对鼻咽癌细胞干细胞特性的影响及调控化疗药物敏感性的具体作用机制。 （4） 通过western blotting实验和双荧光素酶报告基因实验验证miR-296的预测靶点。 【结果】 （1） 通过公共数据芯片分析和对临床组织标本miR-296表达量的检测，我们发现miR-296在鼻咽癌组织中表达明显低于在癌旁组织或鼻咽炎症组织的表达。此外，我们实验室的鼻咽癌细胞系验证结果也发现，相比于永生化的鼻咽上皮细胞NP69，miR-296在鼻咽癌细胞系中低表达。根据miR-296的表达情况，后续实验选择5-8F、CNE-2和CNE-1作为研究细胞。 （2）划痕实验、Transwell转移实验和transwell侵袭实验发现miR-296 mimics转染CNE-2和5-8F细胞后，其迁移能力及侵袭能力明显减弱；Western blotting实验结果显示N-Cadherin、β-Catenin、ZEB1、Snail、MMP1、MMP2、MMP9的蛋白表达水平显著降低；qRT-PCR结果发现侵袭转移相关的部分基因表达水平也显著降低。相反，划痕实验、Transwell 转移实验和 Transwell 侵袭实验结果显示 miR-296 inhibitor转染CNE-1细胞后，其迁移能力及侵袭能力显著增强；Western blotting实验结果显示N-Cadherin、β-Catenin、ZEB1、Snail、MMP1、MMP2、MMP9的蛋白表达水平明显增加；qRT-PCR结果发现侵袭转移相关的部分基因表达水平也明显升高。 （3） AnnexinV-FITC实验、CCK8实验、平板克隆形成实验结果显示，CNE-2、miR-296 mimics转染5-8F细胞后，miR-296可增加鼻咽癌细胞对顺铂的敏感性；同时，Western blotting实验结果显示Bcl-xL蛋白表达降低，而Clealved Caspase-3蛋白表达明显增加； Western blotting实验和qRT-PCR实验结果显示miR-296可引起Oct4、Sox2、Nanog和KLF4的蛋白和基因表达水平降低；此外，罗丹明123蓄积实验结果显示过表达miR-296的CNE-2与5-8F细胞具有较弱的药物外排活性。而miR-296 inhibitor转染CNE-1细胞后，却得到相反的结果。 （4） miR-296 mimics 转染CNE-2和5-8F细胞后，Western blotting结果显示Stat3、p-stat3和TGF-β蛋白水平明显降低，qRT-PCR结果发现TGF-β通路下游的SMAD2、SMAD3和SMAD4基因的表达下降；此相反， miR-296 inhibitor转染CNE-1细胞后，Western blotting实验结果显示Stat3、p-Stat3和TGF-β蛋白水平均有显著升高，qRT-PCR结果发现TGF-β通路下游的SMAD2、SMAD3和SMAD4基因的表达明显上升。wt-STAT3/TGFB1 3UTR 双荧光素酶质粒与 miR-296 mimics/inhibitor 共转染A549细胞后，利用双荧光素酶实验证实STAT3和TGFB1是miR-296的作用靶点。 【结论】 MicroRNA-296在鼻咽癌中明显低表达；miR-296可能通过靶向调控STAT3和TGFB1基因的表达进而抑制鼻咽癌细胞的侵袭转移能力；miR-296可能通过抑制鼻咽癌细胞的干性增加鼻咽癌细胞对顺铂的药物敏感性。