【摘 要】
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在我们的研究中,能够定量地分析比较植物细胞中转录产物水平的差异非常重要.因此,我们以此为突破点,试图从多方面寻找提高cDNA合成的质量、数量和稳定性的方法.众所周知,cDNA
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在我们的研究中,能够定量地分析比较植物细胞中转录产物水平的差异非常重要.因此,我们以此为突破点,试图从多方面寻找提高cDNA合成的质量、数量和稳定性的方法.众所周知,cDNA合成过程对于定量研究转录水平存在重要影响,而且其数量和质量也直接影响定量的精确性.所以,我们以α-Tubulin作为研究对象,利用半定量PCR和实时PCR相结合来评价不同引物以及其工作浓度和DTT的存在对于cDNA合成的影响.为了建立模式系统,我们构建了两个表达载体,Double35S-GFP和-90-GFP.在GFP编码区前面引入了一段具有很强功能的翻译启始保守序列,其中-3位的A和+4位的G符合Kozak consensus,-10 A则是能够特异性地提高白三叶细胞内蛋白质基因翻译效率的保守位点.同时两个新的酶切位点ClaI,XhoI也被引入到GFP的5UTR末端,以后将在此处插入新的功能序列以便研究UTR的二级结构对GFP表达的影响.将这两个表达载体导入农杆菌,获得的农杆菌菌株AGL1pSoup-pG0020和AGL1pSoup-pG0023用来转化白三叶草叶片.我们还从白三叶草植物基因组DNA中克隆获得了Tubulin基因家族的3个新的DNA片段.它们是793 bps的Tubulin 2(GenBank accession number:AY569008),755 bps的Tubulin 4(GenBank accession number:AY570543)和717 bps的Tubulin 7(GenBank accessi on number:AY570544).
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