目的：1.中药苷类成分具有广泛的药理活性,一些苷类成分对CNS疾病的治疗有重要作用,但因透膜性能差,生物利用度低,难以透过BBB等问题限制其临床应用。本文选择天麻素(GAS)、芍药苷(PAE)和松果菊苷(ECH)为模型药,通过研究模型药在体外BBB细胞模型上双侧表观渗透系数、蛋白抑制剂以及紧密连接调节剂对模型药双侧表观渗透系数的影响,从而阐明模型药的跨膜转运机制,找出模型药难以透过BBB的原因,为下一步采取有效措施解决苷类成分难透BBB的问题提供理论依据。2.经过文献调研,发现中药川芎可提高一些苷类成分在脑组织的浓度,且川芎常与含有苷类成分的中药配伍治疗脑部疾病,因此以川芎活性成分为研究对象,通过川芎活性成分对模型药在体外BBB细胞模型上跨膜转运性能的影响,阐明川芎促透作用的物质基础,从配伍的角度解决苷类成分难透BBB的问题,为将苷类成分更加有效的用于治疗CNS疾病提供新的解决途径。3.研究川芎中的活性成分对BBB上的外排蛋白、紧密连接蛋白表达的影响,从分子机理水平阐明川芎活性成分促进苷类成分透过BBB的作用机制,为开发潜在的透BBB促进剂,为解决药物难以透过BBB的瓶颈问题奠定基础。方法：1.将大鼠单次给药及连续灌胃给川芎提取物7天后,荧光分光光度计法测定川芎提取物作用下大鼠脑中的EB含量,研究川芎对BBB通透性的影响,从而确定川芎是否具有作为“佐使药”协助其他药物透过BBB的作用。2.建立GAS.PAE及ECH的LC-MS/MS含量测定方法；采用MDCK、MDCK-MDR1建立体外BBB细胞模型,并通过电镜显微观察、荧光素钠渗漏实验等对细胞模型进行验证；测定不同浓度GAS。PAE及ECH在MDCK.MDCK-MDR1细胞模型上双侧表观渗透系数Papp(A→B)及Papp(B→A)；并分别以外排蛋白P-gp抑制剂(维拉帕米)、MRP1抑制剂(丙磺舒)以及细胞间紧密连接调节剂(EDTA)为工具,通过它们对GAS、PAE及ECH双侧表观渗透系数Papp(A→B)及Papp(B→A)的影响,阐明GAS、PAE及ECH在BBB上跨膜转运机制。3.采用MDCK-MDR1建立体外BBB细胞模型,分别给予不同浓度的FA、TMP、LIG、 SENA、SENI与同一浓度的GAS、PAE及ECH,研究GAS、PAE及ECH的表观渗透系数Papp(A→B),并与模型药单独给药相比,配伍对模型药Papp(A→B)的影响,找到川芎中具有促透作用的活性成分以及促透的剂量。4.采用分子对接法对三个苷类成分,川芎中的5个活性成分,以及P-gp抑制剂维拉帕米、MRP1抑制剂丙磺舒、打开紧密连接的EDTA,分别与P-gp、MRP1、claudin、ZO-1蛋白进行分子对接,分析这些成分与蛋白的结合方式,LibDock Score评价结合能力的强弱,从是否竞争性结合蛋白的角度阐明川芎的促透机制；以P-gp底物罗丹明123为荧光探针,研究不同浓度的川芎活性成分TMP、FA、LIG、SENA和SENI以及P-gp抑制剂维拉帕米对其细胞蓄积的影响,从川芎活性成分调节P-gp蛋白的外排功能角度阐明川芎的促透机制；蛋白质印记法研究不同浓度的川芎活性成分对P-gp、MRP1. claudin-5、ZO-1蛋白表达的影响,从蛋白分子水平上阐明川芎的促透机制；RT-PCR研究川芎活性成分对MDR1 mRNA表达的影响,从分子水平上阐明川芎的促透机制。采用荧光法测定给药前后分子探针在水平方向和垂直方向的荧光强度,计算细胞膜的各向异性值,从川芎活性成分对细胞膜流动性的调节作用阐明川芎的促透机制。结果：1.川芎单次给药组与空白对照组相比,大鼠脑组织中的EB含量随着川芎给药剂量的增加而增加,但是无显著性差异(p>0.05),同时对EB的促透作用最多可增加到35%左右。川芎连续给药组均显著大于川芎单次给药组对EB的促透作用。川芎提取物连续给药组与空白对照组相比,大鼠脑组织中的EB含量随着给药剂量的增加而增加,其中,1.26,2.52, 3.78gkg-1给药剂量具有显著性差异(p<0.05),均能使EB含量增加80%左右。无论单次给药还是多次给药,当川芎的给药剂量大于1.26 g-kg-1时,对大鼠脑内的EB含量变化影响较小,因此表明川芎对BBB通透性的调节作用是有限的。另外,川芎提取物为水提取物,含有以阿魏酸为主的酚酸类成分,单次给药对BBB通透性调节能力较弱,但长期给药后能显著性能促进EB透过BBB,表明该类成分对BBB的调节能力较弱,且调节能力与作用时间有关。2.建立了MDCK、MDCK-MDR1体外BBB细胞模型,透射电镜下细胞呈“铺路石”状,规则,排列紧密,紧密连接清晰可见,细胞电阻大于500Ω·cm2,同时荧光素钠无渗漏,表明细胞模型建立成功。GAS、PAE以及ECH在MDCK, MDCK-MDR1上Papp(A→B)均小于1×10-6cm.s-1,属于难透膜的药物,三者之中,ECH的透膜性能最差；另外这三个成分的浓度与转运速率呈线性关系,说明它们在浓度100-800μg·mL-1范围内以被动扩散为主。GAS在MDCK、MDCK-MDR1上的ER差异较大,MDCK-MDR1上的ER值在1-1.5之间,P-gp抑制剂维拉帕米能显著性增加GAS跨膜转运,表明GAS是P-gp底物,它的跨膜转运受到了P-gp的外排作用。PAE在MDCK-MDR1上的ER>2.0,且P-gp抑制剂维拉帕米能显著性增加PAE跨膜转运,表明PAE是P-gp底物,另外MRP1抑制剂丙磺舒也能显著性增加PAE跨膜转运,表明PAE还受到了MRP1的外排作用。ECH在MDCK-MDR1上的ER>2.0,且P-gp抑制剂、MRP1抑制剂均能使ECH的ER值减小,表明ECH的转运受到P-gp和MRP1的外排作用。EDTA均能使GAS、PAE、ECH的表观渗透系数Papp (A→B)值极显著性增加(p<0.01),表明GAS、PAE、ECH也存在细胞旁路转运。3. LIG、SENA和SENI均可以显著性提高GAS、PAE和ECH的Papp (A→B)发挥促透作用,且与浓度呈正相关。LIG对GAS的促透作用最强,30μg·mL-1LIG(LIG:GAS=1:20,g/g)可显著性增加GAS的Papp(A→B)(p<0.01); SENA和SENI对PAE促透作用最强,20μg·mL-1SENA或20μg·gmL-1SENI (SENA:PAE= 1:20, SENI:PAE=1:20, g/g)均可显著性增加PAE的Papp(A→B); LIG和SENI对ECH促透作用最强,20μg·mL-1LIG或20μg·mL-1SENI (LIG:ECH= 1:20, SENI:ECH=1:20,g/g)可显著性增加ECH的Papp(A→B)p<0.05)；不同浓度的FA、TMP对GAS、PAE和ECH的Papp (A→B)均无显著性影响(p>0.05)。4.分子对接的结果表明GAS、PAE、ECH均可通过分子内氢键作用与P-gp结合,LibDock Socre值大于阳性药维拉帕米,因此为P-gp底物,其中ECH结构式中含有两个糖基,酚羟基较多,通过分子内氢键的作用与P-gp的结合能力最强。PAE、ECH也可以和MRP1形成分子内氢键,因此也是MRP1的底物。由于川芎中的FA、TMP、LIG、SENA和SENI的与蛋白的相互间作用力较小,LibDock Socre值均小于三个苷类成分,故它们不是通过竞争性结合蛋白来发挥促透作用。LIG、SENA和SENI均可以显著性增加P-gp底物罗丹明123的细胞蓄积,能显著性降低P-gp蛋白的表达,表明这川芎中的这三个成分通过抑制P-gp蛋白的表达来增加GAS、PAE和ECH细胞内蓄积；高浓度的SENI还可以同时抑制MRP1的表达来增加PAE、ECH的细胞内蓄积。LIG、SENA和SENI对MDR1 mRNA表达的抑制能力也较强,因此川芎中的这三个活性成分通过抑制MDR1 mRNA的表达来增加GAS、PAE、ECH的细胞内蓄积。LIG、SENA和SENI还可抑制claudin-5以及ZO-1的表达,通过打开细胞间紧密连接从而促进GAS、PAE和ECH跨膜转运。FA和TMP虽为P-gp底物,也可抑制P-gp的表达,TMP还可以抑制MRP1的表达,但是与GAS、PAE和ECH两两配伍使用时,可能由于GAS、PAE和ECH对P-gp的抑制作用大于FA和TMP,故FA和TMP不能促进GAS、PAE和ECH的跨膜转运。FA和TMP虽然也可抑制claudin-5以及ZO-1的表达,但给药前后细胞电阻值无显著性变化,原因可能为western blot实验时药物与BBB细胞的作用时间为10 h,而跨膜转运实验时FA、TMP与BBB体外细胞作用时间为2.5h,尚未发挥打开细胞间紧密连接的作用,因此对GAS、PAE和ECH无显著性促透作用。川芎中的LIG、SENA和SENI与三个苷类成分配伍后均能降低荧光探针的各向异性,表明LIG、SENA和SENI均能通过增加MDCK-MDR1细胞膜流动性来促进GAS、PAE和ECH细胞内蓄积,并呈一定的量效关系。结论：GAS、PAE和ECH均属于难透过BBB的药物,其中ECH的透膜性能最差。三者均以被动扩散为主,也存在细胞旁路转运,GAS受到P-gp的外排作用,PAE和ECH则受到P-gp和MRP1的外排作用。川芎中的FA和TMP不能促进GAS、PAE和ECH透过BBB。川芎挥发油中的三个活性成分LIG、SENA和SENI均可促进GAS、PAE和ECH透过BBB。LIG、SENA和SENI通过抑制紧密连接蛋白claudin-5和ZO-1的表达来促进GAS跨膜转运,同时还可抑制P-gp的表达减少GAS的外排从而增加GAS的细胞内蓄积；LIG、SENA和SENI通过抑制紧密连接蛋白claudin-5和ZO-1的表达,抑制P-gp的外排作用,SENI还协同抑制MRP1来促进PAE和ECH透过BBB增加细胞内蓄积。LIG、SENA和SENI均通过增加MDCK-MDR1细胞膜流动性来促进GAS、PAE和ECH细胞内蓄积。