小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)和大豆花叶病毒(SMV)检测试剂盒的研制

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从六安市金安区采集有明显花叶或斑驳症状的甜瓜新鲜叶和有明显花叶症状的大豆新鲜叶,提取总RNA并合成cDNA。根据已报道的小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)序列和大豆花叶病毒(SMV)序列设计特异引物,分别扩增ZYMV的全长CP基因和SMV的全长CP基因。  将ZYMV的全长CP基因插入原核表达载体pSBET后在大肠杆菌BL21(DE3) plys S中诱导表达。通过12%SDS-PAGE和5%-20%梯度SDS-PAGE二次制备电泳纯化诱导产物,免疫小鼠,获得经过Western blot分析为特异的抗CP血清。硫酸铵沉淀法与Protein A-Red Sepharose亲和层析相结合提取IgG,获得效价达1:4800的一抗,对西瓜和甜瓜田间样品的间接ELISA检测表明,ZYMV在田间普遍发生,本研究制备的IgG可用于ZYMV检测。  SMV的全长CP基因与其他SMV分离物序列同源性分析结果表明,与目前已报道的SMV不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为85.0%~96.8%,相应推测的氨基酸序列同源性为87.9%~98.9%。将CP基因插入原核表达载体pSBET后在大肠杆菌BL21(DE3)Plys S中诱导表达。通过12%SDS-PAGE和5%-20%梯度SDS-PAGE两次制备电泳纯化诱导产物,免疫家兔获得抗CP血清,Western blot分析对CP具有高度特异性。硫酸铵沉淀法与Protein A-Red Sepharose亲和层析相结合提取IgG,获得效价达1:3800的一抗,可用于田间SMV病样检测。
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