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背景:肝细胞癌已成为全球第五大常见的恶性肿瘤类型,在恶性肿瘤相关死亡的主要原因当中位居第三。由于肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)的病理机制复杂,临床表现隐秘,生化指标敏感性和差特异性较低,因而彻底明确肝癌发生发展过程中的具体分子机制并做出早期诊断,对于提高HCC患者的生存率有着极其重要意义。虽然临床上使用最多的甲胎蛋白是目前诊断HCC最有效的标志物,但仍有约30-40%的患者,这项指标正常,进而导致一些病人漏诊。因此,学者们一直在探索新的HCC诊断标志物和治疗靶点。环状RNA是非编码RNA中的一种,是近些年研究的热点;其在癌症发展中的诊断、治疗及预后价值逐渐被证明。2019年,国内外唯一一篇研究报道中发现,环状RNA Hsa_circ_0008583在HCC组织中表达上调,提示它可能参与了HCC的发生发展,但是,其具体的生物学功能是什么?在HCC细胞水平的表达如何?以及它对肝癌发生发展的作用及作用机制是什么?这些问题尚未见报道。我们准备从此入手,来揭示这罕见报道的肝癌新机制。我们从Circ Interactome数据库中发现,HCC中的抑癌基因miR-1301-3p能与hsa_-circ_0008583靶向结合。通过Starbase 2.0数据库发现,HCC中的促癌基因METTL3(m6A甲基转移酶)的m RNA 3-UTR区域也可以与miR-1301-3p靶向结合。Salmena L等人在2011年提出了竞争内源性RNA(ce RNA)假说,即所有类型的RNA转录本通过竞争与共享的miRNA结合位点来相互结合。ce RNA假说是解释基因表达调控和生物功能的关键理论之一。因此,本课题提出如下科学假说:hsa_circ_0008583通过ce RNA机制与METTL3竞争性结合miR-1301-3p,从而减弱miR-1301-3p沉默METTL3表达的作用,间接促进METTL3的表达,上调RNA甲基化水平,最终诱导HCC细胞的增殖、迁移及侵袭并抑制其凋亡,促进肝癌的发生发展。目的:(1)研究hsa_circ_0008583在HCC组织与细胞中的表达水平,确定hsa_circ_0008583是否如报道那样在HCC中表达上调;并探讨hsa_circ_0008583对HCC细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,进一步确定其在HCC细胞中的作用;(2)通过体内实验(裸鼠成瘤实验)来验证hsa_circ_0008583在体内是否同样发挥着促进HCC肿瘤生长的作用;(3)确定hsa_circ_0008583是否按着ce RNA机制通过调控miR-1301-3p/METTL3信号通路促进HCC的发生发展。方法:(1)首先提取HCC组织和细胞中的总RNA并进行q RT-PCR检测,确定hsa_circ_0008583在HCC组织和细胞中的表达情况;然后,通过转染重组质粒pc DNA-hsa_circ_0008583至Hep3B细胞中,使Hep3B细胞中的hsa_circ_0008583表达上调,并采用q RT-PCR检测表达效率;采用si RNA干扰技术合成si-hsa_circ_0008583转染至Huh-7细胞,使hsa_circ_0008583表达下调,采用q RT-PCR检测沉默效率;最后,通过CCK8法、流式细胞仪以及Transwell实验分别对细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移和细胞侵袭进行检测。(2)采用si RNA干扰技术和裸鼠成瘤实验,化学合成si-has_circ_0008583的慢病毒,将其感染Huh-7细胞,获得稳定表达hsa_circ_0008583敲除的Huh-7细胞系;然后将其注射到裸鼠体内,多个时间段观察三组裸鼠瘤体的体积、重量变化;进而观察沉默hsa_circ_0008583的表达后对肝癌细胞致瘤能力的影响。(3)首先,构建了hsa_circ_0008583 WT、hsa_circ_0008583 Mut、METTL3 3’UTR WT、METTL3 3’UTR Mut、miR-1301-3p mimics、miR-1301-3p inhibitors、si-METTL3、si-hsa_circ_0008583、pc DNA-hsa_circ_0008583以及各种阴性对照,分别两两共转染至Hep3B或Huh-7细胞中,通过荧光素酶报告基因试剂盒检测相应组的荧光素酶活性,进而确定hsa_circ_0008583与miR-1301-3p、miR-1301-3p和METTL3之间的靶标关系以及结合位点;最后,也通过CCK8法、流式细胞仪以及Transwell实验分别对细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移和细胞侵袭进行检测。结果:(1)与邻近的癌旁组织(n=12)相比,HCC组织中hsa_circ_0008583的表达高于癌旁组织(n=12);且HCC细胞中的hsa_circ_0008583表达同样高于正常肝细胞中hsa_circ_0008583的表达(p值均<0.01);另外,Hep3B细胞因转染了hsa_circ_0008583过表达质粒,故hsa_circ_0008583的m RNA表达量增加;hsa_circ_0008583过表达组中Hep3B细胞的增殖、迁移和侵袭能力均增强,而细胞凋亡减少(p值均<0.01);(2)LV-si-hsa_circ_0008583裸鼠组的肿瘤体积相比LV-NC组和Ctrl组的明显减小;此外,LV-si-hsa_circ_0008583裸鼠组的肿瘤重量相比LV-NC组和Ctrl组也明显要低(p值均<0.01);(3)与mimics-NC组相比,miR-1301-3p mimics与hsa_circ_0008583 WT共转染的Hep3B细胞的荧光素酶活性显着下调,然而,miR-1301-3p mimic与hsa_circ_0008583 Mut共转染的Hep3B细胞的荧光素酶活性无显著变化;与mimics-NC组相比,miR-1301-3p-mimics和METTL3 WT共转染的Hep3B细胞的荧光素酶活性显着下调;但miR-1301-3p-mimics和METTL3 Mut共转染的Hep3B细胞的荧光素酶活性无显著变化(p值均<0.01);另外,miR-1301-3pmimics的转染可以逆转hsa_circ_0008583过表达对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用,并逆转hsa_circ_0008583过表达对肝癌细胞凋亡的抑制作用;siMETTL3的转染可以逆转hsa_circ_0008583过表达对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用,并逆转hsa_circ_0008583过表达对肝癌细胞凋亡的抑制作用。miR-1301-3p-inhibitor的转染可以逆转hsa_circ_0008583敲低表达对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用,并逆转hsa_circ_0008583敲低表达对肝癌细胞凋亡的促进作用(p值均<0.01)。结论:环状RNA hsa_circ_0008583在HCC组织和细胞中含量明显升高;hsa_circ_0008583可以促进HCC细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制HCC细胞的凋亡并促进体内HCC肿瘤的生长;Hsa_circ_0008583是通过ce RNA调控机制与METTL3竞争性结合miR-1301-3p,减弱miR-1301-3p对METTL3表达的沉默作用,间接的增加METTL3的表达,提高m6A甲基化水平,从而促进肝细胞癌细胞的增殖、侵袭以及迁移能力,同时抑制细胞的凋亡。