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目的:应用小鼠杂交瘤技术制备能够识别NCOA5蛋白的单克隆抗体;检测乳腺癌标本中NCOA5的表达,并分析NCOA5与相关临床病理指标的相关性;观察沉默NCOA5对于乳腺癌细胞增殖、迁移的影响。方法:利用PCR技术体外扩增NCOA5羧基C端基因片段,将该片段插入原核表达载体pET-41a中;使用IPTG诱导NCOA5重组蛋白的表达;采用SDS-PAGE分析表达产物的可溶性并进行规模化表达,采用Ni-NTA柱亲和纯化NCOA5重组蛋白,采用紫外分光光度计、SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色分析蛋白浓度和纯度;利用小鼠杂交瘤技术制备抗NCOA5的单克隆抗体,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质免疫印迹(Western Blot)、免疫荧光(Immunoflousece)和免疫组化(Immunohistochemistry)方法验证单克隆抗体识别NCOA5的敏感性及特异性;利用PCR技术分段扩增NCOA5 C端基因片段,将其插入pMAL-c2X原核表达载体并进行原核蛋白的表达,通过Western Blot初步分析单克隆抗体所识别表位氨基酸序列;利用所制备的单抗行免疫组化检测NCOA5在乳腺癌标本中的表达,统计其与相关临床病理指标的关系;应用慢病毒技术干扰NCOA5在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中的表达,细胞增殖实验(CCK-8 assay)检测其对细胞增殖的影响,细胞划痕(wound healing)及Transwell实验检测其对细胞迁移的影响。结果:成功构建了pET-41a/NCOA5-C-ter重组质粒用于原核蛋白的表达,考马斯亮蓝染色显示诱导细菌裂解后上清蛋白大小约69 kDa,与预期一致,说明成功表达NCOA5重组蛋白,纯化后考马斯亮蓝染色显示蛋白纯度高、可用于免疫小鼠;杂交瘤细胞经间接ELISA检测成功筛选出一株抗体8B11,抗体效价为1:32,000。Western Blot、免疫荧光及免疫组化方法提示单克隆抗体8B11能够特异性识别细胞内NCOA5,NCOA5定位于细胞核并在多个肿瘤细胞系中存在表达;正确构建了pMAL-c2X/NCOA5-C-ter-N’及pMAL-c2X/NCOA5-C-ter-C’重组质粒用于分段表达NCOA5 C端原核蛋白,考马斯亮蓝染色显示诱导细菌裂解后上清蛋白大小与预期一致,说明重组蛋白表达成功,Western Blot显示8B11能够识别NCOA5蛋白第291-434个氨基酸组成的蛋白;乳腺癌标本的免疫组化结果显示,随着肿瘤的增大,NCOA5表达的阳性表达率升高(P=0.008);在有淋巴结转移组中,NCOA5表达的阳性表达率升高(P=0.042);随着肿瘤TNM分期的增加,NCOA5的阳性表达率逐渐上升(P=0.028);NCOA5在ER阴性标本中阳性表达率显著升高(P=0.006);NCOA5在PR阴性标本中阳性表达率升高(P=0.025);NCOA5表达与年龄、组织学分级、HER-2无明显统计学意义(P>0.05)。慢病毒感染乳腺癌细胞株MDA-MB-231后,Western Blot显示沉默NCOA5表达有效,CCK-8法表明沉默NCOA5后细胞增殖能力下降(P<0.05),细胞划痕(wound healing)及Transwell实验表明沉默NCOA5后细胞迁移能力下降(P<0.01)。结论:(1)利用pET-41a原核表达载体,成功表达并纯化了NCOA5 C端重组蛋白;(2)利用杂交瘤技术成功制备了一株效价高、特异性好单克隆抗体8B11,可用于Western Blot、免疫荧光和免疫组化检测NCOA5的表达情况,其抗原表位范围为NCOA5蛋白第384-434个氨基酸;(3)NCOA5在肝癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌细胞系中均存在表达,NCOA5在乳腺癌中阳性表达与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期及ER、PR的表达水平相关,具有作为肿瘤标志物的潜在价值;(4)沉默乳腺癌细胞MDA-MB-231中NCOA5的表达导致细胞增殖及迁移能力下降,提示NCOA5能够通过ERα以外的途径影响细胞的增殖和迁移能力,为进一步探讨NCOA5参与乳腺癌发生发展过程中的具体机制提供基础。