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目的:根据联合国的统计,到2050年,中国65岁以上的老年人将占总人口的四分之一。在老年人中,血管性痴呆（vascular dementia,VaD）是导致痴呆的主要原因之一,尤以亚洲国家多见,这可能与亚洲国家的脑血管病发病率较欧美国家更高一致[1]。近年来,由于脑血管病的不断增长,人们对于VD的研究越来越重视。目前,VD尚无有效治疗手段,但其被认为是可以有效防治的一种痴呆综合征,而这种可防治主要针对早期阶段。因此,如果能在VD早期阶段时给予积极干预,不仅可取得良好的治疗效果,还可延缓其成为不可逆痴呆状态的进程。本课题旨在探讨当归芍药散主要活性成分芍药内酯苷和丁烯基苯酞对OGD/R诱导损伤的小鼠小胶质细胞（BV2）缺氧缺糖模型的药效作用及其与p38/MAPK-PI3K/AKT信号通路相互串话的关系。方法:通过缺氧缺糖损伤建立小胶质细胞OGD/R模型,设置空白对照组、模型组、依达拉奉组、芍药内酯苷和丁烯基苯酞低、中、高剂量组。各组采用CCK-8试剂检测细胞生存活力,并明确芍药内酯苷和丁烯基苯酞的安全浓度范围,评价芍药内酯苷和丁烯基苯酞给药后的细胞活力;ELISA检测细胞上清中炎症因子TNF-α和IL-1β浓度,流式检测BV2细胞凋亡情况,Hoechst33258染色观察细胞核损伤的荧光强弱变化;Weatern Blot检测PI3K、AKT、p38、ASK、小胶质细胞M1型标志物CD16/32、M2型标志物CD206的蛋白表达情况,检测LC3B、Caspase3、BAX、BCl-2等蛋白的表达。结果:1.OGD/R构建体外细胞缺氧缺糖模型:与空白对照组比较,OGD4h、6h、8h后小胶质细胞BV2的细胞存活率均显著降低（P<0.001）,缺氧缺糖处理4h后复氧12h,细胞存活率略有增加;缺氧缺糖处理6h、8h后复氧12h,细胞存活率有所降低。在OGD4h/R12h条件下处理细胞,可以使细胞存活率在50%左右,确定此为最佳造模条件。2.芍药内酯苷和丁烯基苯酞对BV2细胞活性的影响:与空白对照组相比,10μmol·L-1、20μmol·L-1、40μmol·L-1、80μmol·L-1的芍药内酯苷组细胞存活率均无明显差异（P>0.05）;5μmol·L-1、10μmol·L-1、20μmol·L-1、40μmol·L-1、80μmol·L-1的丁烯基苯酞组细胞存活率均无明显差异（P>0.05）,说明10-80μmol·L-1浓度范围内的芍药内酯苷和5-80 μ mol·L-1浓度范围内的丁烯基苯酞对BV2细胞无明显的毒性作用。3.芍药内酯苷和丁烯基苯酞对OGD/R损伤后BV2细胞活性的影响:与空白对照组相比,模型组的BV2细胞在OGD/R损伤后的细胞存活率显著降低（P<0.001）;与模型组相比较,芍药内酯苷低、中、高剂量组和依达拉奉组细胞存活率明显提高（P<0.01,P<0.001）,且与剂量呈正相关;丁烯基苯酞低、中、高剂量组细胞存活率明显提高（P<0.05,P<0.0.01）。结果说明芍药内酯苷和丁烯基苯酞可以明显提高OGD/R损伤后BV2细胞的存活率。4.芍药内酯苷和丁烯基苯酞对OGD/R损伤后BV2细胞分泌炎症因子TNF-α和IL-1 β的影响:与空白对照组相比,模型组的BV2细胞在OGD/R损伤后的炎症因子TNF-α和IL-1 β浓度显著增加（P<0.001）;与模型组相比较,芍药内酯苷低、中、高剂量组和依达拉奉组TNF-α和IL-1 β浓度显著降低（P<0.001）,且与剂量呈正相关;丁烯基苯酞低、中、高剂量组TNF-α和IL-1β浓度显著降低（P<0.001）。结果说明芍药内酯苷和丁烯基苯酞可以显著降低OGD/R损伤后BV2细胞中炎症因子TNF-α和IL-1β浓度。5.流式细胞分析法检测芍药内酯苷和丁烯基苯酞对OGD/R损伤后BV2细胞凋亡的影响:与空白对照组相比,模型组的BV2细胞在OGD/R损伤后早期及中晚期凋亡比例显著增加（P<0.001）,总凋亡比例显著增加（P<0.001）;与模型组相比较,芍药内酯苷低、中、高剂量组和依达拉奉组细胞早期及中晚期凋亡比例显著降低（P<0.001）,总凋亡比例显著降低（P<0.001）,且总凋亡比例与剂量呈正相关;丁烯基苯酞低、中、高剂量组和依达拉奉组细胞早期及中晚期凋亡比例显著降低（P<0.001）,总凋亡比例显著降低（P<0.001）。结果说明芍药内酯苷和丁烯基苯酞可以明显抑制OGD/R损伤后BV2细胞的凋亡。6.Hoechst33258染色检测芍药内酯苷和丁烯基苯酞对OGD/R损伤后BV2细胞凋亡的影响:空白对照组细胞多为光滑圆形,细胞核为均匀的蓝色;模型组的BV2细胞出现胞核碎片化,大量细胞出现致密浓染,蓝色发白,为凋亡细胞的特征;依达拉奉组和芍药内酯苷与丁烯基苯酞低、中、高剂量组细胞核染色与模型组相比白色偏光明显减少。结果说明芍药内酯苷和丁烯基苯酞可以抑制OGD/R损伤后BV2细胞的凋亡。7.Western Blot检测LC3B、Caspase3、BAX、BCl-2蛋白的表达:与空白对照组相比,模型组LC3B、Caspase3蛋白表达量升高（P<0.01,P<0.001）,BAX/BCl-2比值升高（P<0.001）;与模型组相比,芍药内酯苷和丁烯基苯酞给药组可以降低LC3B、Caspase3蛋白表达（P<0.05,P<0.01,P<0.001）,BAX/BCl-2比值降低（P<0.01,P<0.001）,表明当归芍药散活性成分芍药内酯苷和丁烯基苯酞可以减轻细胞OGD/R诱导的自噬,抑制细胞凋亡。8.Western Blot检测p38、PI3K、AKT、ASK、CD16/32、CD206蛋白的表达:与空白对照组相比,模型组p38和ASK蛋白表达量升高（P<0.01,P<0.001）,PI3K和AKT蛋白表达量降低（P<0.01,P<0.001）;与模型组相比,芍药内酯苷和丁烯基苯酞给药组可以降低p38和ASK蛋白表达（P<0.05,P<0.01,P<0.001）,PI3K和AKT蛋白表达量升高（P<0.05,P<0.01,P<0.001）,表明当归芍药散活性成分芍药内酯苷和丁烯基苯酞可以减轻细胞OGD/R诱导的自噬,减轻炎症反应,抑制细胞凋亡。与空白对照组相比,模型组的BV2细胞在OGD/R损伤后CD16/32蛋白表达量均显著增加（P<0.001）,CD206蛋白表达量均显著降低（P<0.001）;与模型组相比较,芍药内酯苷低、中、高剂量组和依达拉奉组细胞CD16/32蛋白表达量均显著降低（P<0.001）,CD206蛋白表达量均显著增加（P<0.001）,且与剂量呈正相关;丁烯基苯酞低、中、高剂量组细胞CD16/32蛋白表达量均显著降低（P<0.001）,CD206蛋白表达量均显著增加（P<0.05,P<0.01,P<0.001）。结果说明OGD/R促进细胞中CD16/32蛋白的表达,降低CD206蛋白的表达,芍药内酯苷和丁烯基苯酞可以明显降低CD16/32的蛋白表达,升高CD206的蛋白表达。结论:以上研究结果提示,当归芍药散活性成分芍药内酯苷和丁烯基苯酞可以提高OGD/R诱导损伤的BV2细胞活性,调节小胶质细胞M1/M2表型稳态,减轻炎症反应,阻滞细胞自噬,抑制细胞凋亡。其机制可能与P38/MAPK与PI3K/AKT信号通路的调控有关。