论文部分内容阅读
牛轮状病毒(Bovine Rotavirus,BRV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae),轮状病毒属(Rotavirus),是引起犊牛病毒性腹泻的主要病原之一。
本课题将从2009年黑龙江省齐齐哈尔市某养殖场获得一份犊牛腹泻粪便,进行滤菌处理后,于MA104细胞中连续传代,传至第15代时测得为104.384TCID50/100μl;使用电镜观察病毒粒子形态,可以看到直径大小约70nm,呈典型车轮状的病毒粒子;通过核酸类型实验、脂溶剂敏感性实验,证实该病毒为无囊膜的RNA病毒;该病毒耐酸,经50℃水浴30min处理,感染能力下降明显;通过病毒中和实验,将病毒液与牛轮状病毒参考株阳性血清发生中和反应,中和抗体效价达1:145。根据以上初步鉴定结果推测该分离到的病毒为牛轮状病毒,并命名为HQ09株。
根据GenBank中牛轮状病毒NCDV株的序列设计引物,通过RT-PCR扩增了BRV HQ09株的VP5、VP6、VP7、VP8基因。将这四段基因克隆到pMD18-T载体上,进行测序和生物信息学分析:结果表明HQ09 VP6基因的CDS区长度是1194bp,编码一个长度为398个氨基酸的蛋白质,系统遗传进化树分析发现分离株HQ09与标准株NCDV、北美B223处在一个分支,核苷酸同源性分别为99.6%、87.8%,我们得出BRV HQ09属于A群轮状病毒;分离株HQ09 VP4基因的CDS区长度是2331bp,编码一个长度为777个氨基酸的蛋白质,系统遗传进化树分析发现HQ09与P[1]型的标准株NCDV、北美株O Agent、日本株A5、中国山东分离株CHLY处在一个分支,核苷酸同源性分别为99.9%、97.2%、80.9%、99.6%,表明HQ09为P[1]型;HQ09 VP7基因的CDS区长度是981bp,编码一个长度为327个氨基酸的蛋白质,系统遗传进化树分析表明HQ09与G6型的标准株NCDV、北美疫苗株WC3、阿根廷株1730、中国山东分离株CHLY处在一个分支。核苷酸同源性分别为98.9%、97.4%、98.7%、99.6%,上述结果表明BRV HQ09为G6型。
以0.2 mL/只的剂量用BRV HQ09株对小鼠进行灌胃攻毒,感染小鼠出现腹泻,腹泻潜伏期为1~2天,在3~4天腹泻现象较为明显,5~6天时腹泻现象消失;其临床症状表现包括皮毛光泽差,嗜睡,攻击性强,排浅黄色稀软性粪便等;剖检变化为各段肠道均有不同程度的臌气,肠壁变得菲薄,肠内充满黄色稀薄的黏液样或水样内容物;小肠病理组织学变化明显,肠腺和肠绒毛上皮细胞增生、肿胀、黏液变性、坏死和脱落,小肠绒毛顶端破损,有大量内容物弥散在肠道中,黏膜固有层呈轻度细胞浸润,腺体萎缩破坏。动物实验结果进一步证实小鼠可作为BRV感染动物模型。