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丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)是输血后导致的非甲非乙型肝炎主要病原体,HCV慢性感染可以导致慢性肝脏炎症、纤维化甚至肝癌。据世界卫生组织统计,全球约有1.8亿人感染HCV,每年新发病例300～400万。中国是HCV高度感染区,感染人数约4100万。HCV基因高度变异,根据其核酸序列同源性,可将HCV分为7种基因型以及多种亚型。不同基因型的HCV具有明显的地区分布差异,在云南主要流行的基因型包括1型、3型和6型。干扰素/利巴韦林联合疗法是丙型肝炎的常用治疗方法,此疗法对不同基因型HCV的疗效差异大,并伴有明显的副作用。近年来研发的抗HCV药物主要包括HCVNS3/4A蛋白酶抑制剂(Telaprevir、Boceprevir 和 simeprevir)和 HCVNS5B 聚合酶抑制剂(Sofosbuvir),但仍存在药物毒副作用大和价格昂贵等问题,亟待开发新的抗HCV药物。亲环素A可与HCVNS5A有效结合,促进NS5A中的脯氨酸肽键的异构化效应,亲环素抑制剂可通过破坏亲环素A与NS5A的相互作用达到抑制病毒复制的作用。本研究在2a型嵌合体病毒J6/JFH1感染Huh 7.5.1细胞培养体系的基础上,以干扰素和利巴韦林为阳性对照,进行亲环素抑制剂环孢素A类和待测化合物NEW的HCV活性测定。经测定,阳性指控IFNα-2b的EC50值为0.194 IU/mL;RBV的IC50值为22.87 μg/mL,EC50值为2.445μg/mL,SI值为9.354。经初步筛选,7个化合物在浓度范围0.010-3.00 μmol/L内,均表现出了较好的抗病毒活性:CsA的EC50=0.118 μmol/L、4-OH-CsA的EC50=0.052 μmol/L、NIM811 的EC50=0.010μmol/L、SCY635的EC50=0.146 μmol/L、NEW-80的EC50=0.088 μmol/L、NEW-U的EC50=0.125μmol/L、NEW-C的EC50=0.053 μmol/L。这7种药物均没有表现出明显的细胞毒性作用。而且NEW的EC50值较低,具有较大的开发价值。为验证人血清浓度对化合物毒性和抗病毒效果的影响,在不同人血清浓度测定NEW和CsA这两个化合物抗HCV活性。结果表明CsA在不同人血清浓度5%、10%和20%情况下,其细胞毒性略递减,抗病毒活性的EC50值分别是0.026 μmol/L、0.053 μmol/L和0.038 μmol/L,血清对其活性没有显著影响。NEW在5%、10%和20%人血清浓度下,细胞毒性也有着略微降低趋势,抗病毒活性的EC50值为0.018 μmol/L、0.178 μmol/L和0.177 μmol/L,血清浓度高时可降低药物的抗病毒活性,血清浓度达到一定水平后,对药物活性的影响不明显。以EC90值作为评价指标对药物作用不同时间抗病毒效果比较发现,前24h内CsA对HCV抑制作用已达到80%左右,而作用的前12h,其对病毒的抑制效果已经比较明显。利用EC00、EC20、EC50、EC80四个药物浓度来处理,通过western blot实验检测NS5A蛋白表达水平,随着药物浓度升高,NS5A蛋白表达量明显降低。鉴于化合物NEW无明显细胞毒性,我们将其细胞毒性实验的药物浓度提高到了31.60 μmol/L,仍然没有明显的细胞毒性。不同批次的NEW和CsA进行抗HCV活性筛选中,NEW的EC50值是0.034μmol/L±0.009,比CsA的EC50值0.071μmol/L±0.028测定的重复性更好。我国及云南省以1型为主要流行HCV基因型,有必要构建HCV 1b型亚基因组复制子细胞模型,以用于病毒感染与治病机制研究。我们在APP76(Con1SG-Neo(Ⅰ)hRluc2aUb)质粒上用分泌型荧光素酶基因片段替换融合型荧光素酶基因片段,质粒线性化后进行体外转录成RNA,转染入肝细胞系Huh 7.5.1,经高浓度G418强压筛选3周左右,得到含有1b型HCV亚基因组复制子的细胞集落。降低G418浓度对这些细胞集落进行扩大培养,构建含HCV 1b亚基因组复制子的稳定细胞系。提取复制子细胞总RNA,并通过RT-PCR来验证细胞中HCV亚基因复制子的片段。经鉴定,含有NS5B和Sluc两段基因序列。本研究在2a型嵌合体病毒J6/JFH1感染Huh 7.5.1细胞培养体系的基础上,在进行初筛和复筛实验过程后,筛选出一个具有较高开发价值的环孢素A类化合物—NEW。并成功构建了HCV 1b型亚基因组复制子细胞模型,为研究HCV治疗药物的研发提供了基础。