目的：　　探讨三种烤瓷基底冠金属（镍铬合金、钴铬合金和金钯合金）浸提液对体外培养的人牙龈成纤维细胞(Human gingival fibroblast, HGF)分泌炎症因子白细胞介素-17(Interleukin-17, IL-17)、白细胞介素-21(Interleukin-21, IL-21)、环加氧酶2（Cyclooxygenase2, COX-2）的影响及对人牙龈成纤维细胞细胞排列及形态的影响，以此评价三种合金的生物相容性，为临床烤瓷合金材料的选择及肩台设计提供参考依据。　　材料和方法：　　1．材料：　　主要试剂和仪器：达尔伯克改良伊格尔培养液(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM)(高糖含双抗)，磷酸盐缓冲液(phosphate—buffered saline, PBS)，10％胎牛血清（FBS），含乙二胺四乙酸的0.25％胰蛋白酶，鼠抗人波形丝蛋白单克隆抗体，IL-17 ELISA试剂盒，IL-21 ELISA试剂盒，环加氧酶2 ELISA试剂盒,全自动CO2孵箱，医用超净工作台，倒置显微镜，EPOCH自动酶标分析仪。镍铬合金、钴铬合金、金钯合金均由上海沪祥齿科有限公司加工制作。各种合金质量分数分别为（见表1）：镍铬合金：镍64％、铬22％、钼10％、硅2％、铌1％、锰0.5％、硼0.5％；钴铬合金：钴60％、铬25％、钨6％、钼4％、铁、铌、硅、锰≤5％；金钯合金：金51％、钯25％、银19％、锢4％、铂0.4%、铱、镓、锌≤l％。　　2．方法：　　2.1.人牙龈成纤维细胞的培养及鉴定　　选取台州市中心医院口腔科，行微创种植手术时，用种植器械环钻切除下来的健康牙龈组织，告知患者，此组织将被用于临床研究，取得患者的知情并同意,并签署了知情同意书，并取得了伦理委员会的同意。在超净医用工作台上用含有双抗(青霉素100ug/ml、链霉素100ug/m1)的PBS仔细认真地清洗，彻底地洗干净标本（牙龈组织）上的血渍。将牙龈组织修剪成3 mm×3 mm x3mm大小，加入1ml0.25％胰蛋白酶，在37℃条件下消化30 min，最后用1ml的DMEM培养液来停止胰蛋白酶的消化。将牙龈组织转移至离心管离心，1000 r／min(离心半径=13cm)离心5min。将离心好的牙龈组织块取出来，均匀地放在培养瓶的底部，将底部倒置，放进37℃，5％CO2，95％湿度条件的用于细胞培养的孵箱中，4h后翻转培养瓶，加入2-3 ml含有10％胎牛血清的DMEM培养液静置培养，3-5 d换液1次。当细胞慢慢生长，细胞爬满培养瓶底的80％～90％，且细胞没有受到污染时，继续传代，第一次传代的比例为1：1，之后传代的比例为1：2。把对数生长期的第4代人牙龈成纤维细胞取出来，放在倒置显微镜下观察细胞的形态，再用鼠抗人波形丝蛋白单克隆抗体进行免疫染色，鉴定细胞的来源。　　2.2.制备金属浸提液　　将3种金属铸造成直径5.5mm、高2.4mm的圆柱体（见图1），进行常规的喷砂、打磨、抛光，并进行清洗、灭菌，等干燥后备用。将3种金属分别放入EP管中，并加入DMEM培养液1.5 ml，并将EP管放在用于细胞培养的孵箱中，在37℃，5％C02，95％湿度的无菌条件下静置，14 d后，采集金属浸提液。　　2.3.实验分组　　A组：镍铬合金（Ni-Cr）浸提液；B组：钴铬合金（Co-Cr）浸提液；C组：金钯合金（Au-Pd）浸提液；D组：空白对照组，没有行金属浸提的DMEM培养液。　　2.4.酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测IL-17、IL-21、环加氧酶2的量并观察人牙龈成纤维细胞的细胞形态　　将生长良好的第5代人牙龈成纤维细胞取出来，用于实验。把细胞消化后制成的细胞悬液，接种在96孔板中(为IL-17，IL-21，环加氧酶2的ELISA试剂盒)，等细胞贴壁生长后，往各孔中加入2ml含10％胎牛血清的DMEM培养液。等待细胞繁殖，当细胞长满孔底的80％-90％时，丢弃孔内的培养液，用PBS冲洗3次，分别于各实验组中加入镍铬（Ni-Cr）、钴铬（Co-Cr）、金钯（Au-Pd）合金的金属浸提液2ml，空白对照组加入DMEM培养液2ml，每组设置4个复孔。将孔板放置在细胞培养孵箱中，在37℃，5％CO2，95％湿度的条件下孵育，分别于孵育1h、6h、12h、24 h时收集孔板中的上清液。根据说明书（酶联免疫吸附测定试剂盒中的使用说明书）操作，在450nm波长的条件下，用自动酶标分析仪测定各孔在不同时间段收集的上清液的吸光度值(A值)，通过IL-17,IL-21,环加氧酶2的标准品的质量浓度及对应的A值来计算标准曲线的直线回归方程，再根据测得的样品A值，利用回归方程计算出样品的IL-17,IL-21,环加氧酶2的质量浓度。　　结果：　　1.第四代人牙龈成纤维细胞的形态学表现　　将人牙龈成纤维细胞放倒置显微镜下观察，可见细胞呈长梭形，胞体丰满，胞浆突2-4个，胞浆均匀，透明度大。细胞核呈椭圆或圆形，单核，位于细胞的中央，核仁清晰，核仁有1-3个(见图2)。　　2.人牙龈成纤维细胞的免疫鉴定　　抗波形丝蛋白染色阳性，细胞胞浆棕黄色染色，细胞核染成蓝色(见图3)，符合中胚层来源的成纤维细胞样细胞的特征。　　3.不同烤瓷基底冠金属浸提液对人牙龈成纤维细胞细胞形态的影响　　观察不同烤瓷基底冠金属浸提液对人牙龈成纤维细胞作用1h、6h、12h、24h的细胞形态，选取12h、24h的细胞形态附上（考虑细胞图片太多，选取作用时间长的细胞形态）（见图4、图5）。结果显示：在对照组中，细胞生长旺盛，形态良好，为细长梭型，排列紧密；金钯合金、钴铬合金组，细胞排列较对照组稍稀疏，形态较好，少量细胞皱缩为圆形，大部分仍然为细长梭型；镍铬合金组，细胞数量减少，排列更稀疏，少量细胞皱缩为圆形，大部分仍然为细长梭型，但出现形态消失的牙龈成纤维细胞，漂浮于培养液中。　　4.不同烤瓷基底冠金属浸提液作用人牙龈成纤维细胞，观察对人牙龈成纤维细胞分泌IL-17的影响（见表2，图6）　　ELISA检测结果显示：烤瓷基底冠金属浸提液对人牙龈成纤维细胞作用1小时，细胞上清液中IL-17的浓度均值分别为：对照组（D）：20.71±0.98pg/ml，镍铬烤瓷合金组(A)：23.95±2.91pg/ml，钴铬烤瓷合金组(B)：23.94±2.46pg/ml，金钯烤瓷合金组(C)：25.44±4.38pg/ml。烤瓷基底冠金属浸提液对人牙龈成纤维细胞作用6小时，细胞上清液中IL-17的浓度均值分别为：对照组（D）：52.49±2.31pg/ml，镍铬烤瓷合金组(A)：60.95±4.30pg/ml，钴铬烤瓷合金组(B)：61.19±3.21pg/ml，金钯烤瓷合金组(C)：54.54±2.95pg/ml。烤瓷基底冠金属浸提液对人牙龈成纤维细胞作用12小时，细胞上清液中IL-17的浓度均值分别为：对照组（D）：88.05±2.64pg/ml，镍铬烤瓷合金组(A)：133.25±8.69pg/ml，钴铬烤瓷合金组(B)：109.74±9.81pg/ml，金钯烤瓷合金组(C)：95.27±4.79pg/ml。烤瓷基底冠金属浸提液对人牙龈成纤维细胞作用24小时，细胞上清液中 IL-17的浓度均值分别为：对照组（ D）：194.28±4.97pg/ml，镍铬烤瓷合金组(A)：274.34±3.59pg/ml，钴铬烤瓷合金组(B)：231.86±9.60pg/ml，金钯烤瓷合金组(C)：207.10±2.42pg/ml。　　ELISA检测结果经统计分析，结果显示如下：烤瓷合金浸提液对人牙龈成纤维细胞作用1h时，四组分泌IL-17量的差异无统计学意义（P>0.05）；烤瓷合金浸提液对人牙龈成纤维细胞作用6h、12h、24h时，四组分泌IL-17量的差异有统计学意义（P<0.05）。两两比较结果显示：烤瓷合金浸提液对人牙龈成纤维细胞作用6h时，A、B组分别与D组之间差异有统计学意义（P<0.05），C组与D组之间， A组与B组之间，差异无统计学意义（P>0.05）；烤瓷合金浸提液对人牙龈成纤维细胞作用12h时，A、B组分别与D组之间、A、B组之间差异均有统计学意义（P<0.05），C、D组之间差异无统计学意义（P>0.05）；烤瓷合金浸提液对人牙龈成纤维细胞作用24h时，A、B、C与D组之间、A、B、C组之间差异均有统计学意义（P<0.05）。说明钴铬合金和镍铬合金浸提液对人牙龈成纤维细胞分泌IL-17是有影响的，作用12h之前，两者无明显差异，到24h时，两者有明显的差异，镍铬合金组人牙龈成纤维细胞分泌IL-17的量多于钴铬合金组；金钯合金浸提液对人牙龈成纤维细胞分泌IL-17的影响，在作用24h之前与对照组未见明显差异，但到24h时，两者有明显的差异，说明金钯合金对人牙龈成纤维细胞分泌IL-17也是有影响的。　　烤瓷合金浸提液对人牙龈成纤维细胞分泌IL-17的影响，从图6可见各组合金浸提液从1h到24h，其分泌IL-17量都是增加的。　　5.不同烤瓷基底冠金属浸提液作用人牙龈成纤维细胞，观察对人牙龈成纤维细胞分泌IL-21的影响（见表3，图7）　　ELISA检测结果显示：烤瓷基底冠金属浸提液对人牙龈成纤维细胞作用1小时，细胞上清液中IL-21的浓度均值分别为：对照组（D）：43.07±4.24pg/ml，镍铬烤瓷合金组(A)：46.66±2.57pg/ml，钴铬烤瓷合金组(B)：45.45±3.78pg/ml，金钯烤瓷合金组(C)：44.67±3.14pg/ml。烤瓷基底冠金属浸提液对人牙龈成纤维细胞作用6小时，细胞上清液中IL-21的浓度均值分别为：对照组（D）：92.64±3.55pg/ml，镍铬烤瓷合金组(A)：155.62±5.68pg/ml，钴铬烤瓷合金组(B)：133.45±8.43pg/ml，金钯烤瓷合金组(C)：105.93±5.37pg/ml。烤瓷基底冠金属浸提液对人牙龈成纤维细胞作用12小时，细胞上清液中 IL-21的浓度均值分别为：对照组（ D）：216.35±19.55pg/ml，镍铬烤瓷合金组(A)：397.59±13.16pg/ml，钴铬烤瓷合金组(B)：328.66±8.59pg/ml，金钯烤瓷合金组(C)：287.60±6.42pg/ml。烤瓷基底冠金属浸提液对人牙龈成纤维细胞作用24小时，细胞上清液中IL-21的浓度均值分别为：对照组（D）：529.24±1.86pg/ml，镍铬烤瓷合金组(A)：828.90±12.81pg/ml，钴铬烤瓷合金组(B)：663.47±27.93pg/ml，金钯烤瓷合金组(C)：569.46±1.61pg/ml。　　ELISA检测结果，经统计分析，结果显示，烤瓷合金浸提液对人牙龈成纤维细胞作用1h时，A、B、C三组分别与D组比较，分泌IL-21量的差异无统计学意义（P>0.05）；烤瓷合金浸提液对人牙龈成纤维细胞作用6h、12h、24h时, A、B、C三组分别与D组比较，分泌IL-21的量的差异有统计学意义（P<0.05），两两比较显示： A、B、C组之间的差异均有统计学意义（P<0.05）。说明三种金属浸提液均促进人牙龈成纤维细胞分泌IL-21，其中镍铬合金浸提液组分泌IL-21的量最多，金钯合金组分泌IL-21的量最少。　　烤瓷合金浸提液对人牙龈成纤维细胞分泌IL-21的影响，从图7可见各组合金浸提液从1h到24h，其分泌IL-21的量是增加的。　　6.不同烤瓷基底冠金属浸提液作用人牙龈成纤维细胞，观察对人牙龈成纤维细胞分泌环加氧酶2的影响（见表4，图8）　　ELISA检测结果显示：烤瓷基底冠金属浸提液对人牙龈成纤维细胞作用1小时，细胞上清液中环加氧酶2的浓度均值分别为：对照组（D）：1024.08±48.25pg/ml，镍铬烤瓷合金组(A)：1000.42±80.82pg/ml，钴铬烤瓷合金组(B)：968.18±58.64pg/ml，金钯烤瓷合金组(C)：1008.24±76.61pg/ml。烤瓷基底冠金属浸提液对人牙龈成纤维细胞作用6小时，细胞上清液中环加氧酶2的浓度均值分别为：对照组（D）：1068.19±27.83pg/ml，镍铬烤瓷合金组(A)：1445.62±64.07pg/ml，钴铬烤瓷合金组(B)：1270.21±52.41pg/ml，金钯烤瓷合金组(C)：1192.00±66.15pg/ml。烤瓷基底冠金属浸提液对人牙龈成纤维细胞作用12小时，细胞上清液中环加氧酶2的浓度均值分别为：对照组（ D）：4293.88±923.94pg/ml，镍铬烤瓷合金组(A)：7759.33±633.97pg/ml，钴铬烤瓷合金组(B)：6719.51±523.43pg/ml，金钯烤瓷合金组(C)：5742.89±290.58pg/ml。烤瓷基底冠金属浸提液对人牙龈成纤维细胞作用24小时，细胞上清液中环加氧酶2的浓度均值分别为：对照组（D）：5498.45±370.65pg/ml，镍铬烤瓷合金组(A)：15675.68±2076.45pg/ml，钴铬烤瓷合金组(B)：11834.22±1996.73pg/ml，金钯烤瓷合金组(C)：7533.41±1064.75 pg/ml。　　ELISA检测结果经统计分析，结果显示：烤瓷合金浸提液对人牙龈成纤维细胞作用1h时，A、B、C三组分别与D组比较，分泌环加氧酶2的量无明显差异，（P>0.05）；烤瓷合金浸提液对人牙龈成纤维细胞作用6h、12h时, A、B、C三组分别与D组比较，分泌环加氧酶2的量存在差异（P<0.05）；烤瓷合金浸提液对人牙龈成纤维细胞作用24h时，A、B两组分别与D组比较，分泌环加氧酶2的量存在差异（P<0.05）。两两比较显示：烤瓷合金浸提液对人牙龈成纤维细胞作用6h、12h时，A组分别与B、C组之间比较，分泌环加氧酶2量的差异有统计学意义（P<0.05），B组与C组间，差异无统计学意义（P>0.05）；烤瓷合金浸提液对人牙龈成纤维细胞作用24h时，A、B组之间，分泌环加氧酶2的量的差异有统计学意义（P<0.05）。说明钴铬合金和金钯合金浸提液对人牙龈成纤维细胞分泌环加氧酶2量的影响，在24h之前，两者无明显差异，到24h时，钴铬合金组人牙龈成纤维细胞分泌环加氧酶2的量多于金钯合金组；金钯合金浸提液对人牙龈成纤维细胞分泌环加氧酶2量的影响，在24h之前，金钯合金组和对照组比较是有差异的，金钯合金组分泌的环加氧酶2的量多于对照组，到24h时，金钯合金组与对照组比较，分泌环加氧酶2的量无明显差异，说明金钯合金潜在抗炎作用较弱。　　烤瓷合金浸提液对人牙龈成纤维细胞分泌环加氧酶2的影响，从图8可见各组合金浸提液从1h到24h，其分泌环加氧酶2的量都是增加的。　　结论：　　1.体外成功地培养了人牙龈成纤维细胞。　　2.镍铬烤瓷合金浸提液对人牙龈成纤维细胞的排列、细胞形态的影响显著高于钴铬烤瓷合金、金钯烤瓷合金，而金钯烤瓷合金浸提液的影响最小。　　3.镍铬烤瓷合金、钴铬烤瓷合金、金钯烤瓷合金浸提液均促进人牙龈成纤维细胞对IL-17、IL-21、环加氧酶2等炎症因子的释放。镍铬烤瓷合金浸提液对人牙龈成纤维细胞分泌IL-17、IL-21、环加氧酶2的影响最大，金钯烤瓷合金浸提液对人牙龈成纤维细胞分泌IL-17、IL-21、环加氧酶2的影响最小。　　4.镍铬烤瓷合金的生物相容性最差，尽量避免龈下肩台的设计，金钯烤瓷合金的生物相容性最好，可以行龈下肩台的设计。