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目前大量研究证实，BMP-2在体内、体外均可促进细胞增殖，诱导细胞向成骨细胞转化，促进骨形成。其与种子细胞和支架材料复合后构建的组织工程骨，可通过骨引导和骨诱导方式共同完成骨修复和重建。然而BMP-2外源性植入效价低且移植骨血运问题没有得到有效解决。因此本研究采用基因治疗的策略，将BMP-2基因导入骨髓基质干细胞，并种植到去抗原异种骨支架中，构建BMP-2基因治疗的组织工程骨，期望利用细胞运载BMP-2到特定的损伤部位并稳定释放。在裸鼠皮下（异位）及兔桡骨节段性骨缺损处（骨损伤部位），观察转基因细胞分泌的BMP-2促进成骨及血管化的效果。并且采用显微外科技术，分别将带血管蒂的骨膜和血管束植入与BMP-2基因治疗的组织工程骨联合移植来修复骨缺损，观察额外增加血运对加速骨愈合的影响，为探索适合临床应用的组织工程骨修复的最佳方式奠定实验基础。一、BMP-2腺病毒载体转染hBMSC及基因治疗的组织工程骨体外构建BMP-2重组腺病毒表达载体的构建、扩增和滴度测定利用携带人BMP-2基因的腺病毒穿梭质粒pAdCMV-BMP-2，在脂质体介导下，与腺病毒基因组质粒pJM17共转染293细胞，经同源重组获得BMP-2腺病毒表达载体（Ad-BMP-2）。PCR扩增及基因测序鉴定，证明BMP-2基因被成功构建进腺病毒载体中。通过感染293细胞大量扩增重组病毒，测定病毒滴度为2×1010 pfu/ml。 <WP=96>2．Ad-BMP-2体外转染人骨髓基质干细胞及转染后BMP-2表达检测 体外培养人骨髓基质干细胞（hBMSC），诱导其向成骨细胞、脂肪细胞转化以鉴定其多向分化潜能。然后将Ad-BMP-2转染hBMSC，通过免疫细胞化学、原位杂交染色检测细胞内BMP-2表达；Western blot检测转染后细胞培养液中BMP-2分泌蛋白表达。同等条件下Ad-Lacz对照腺病毒载体转染细胞，X-gal免疫染色观察转染效率。证实BMP-2基因可高效导入细胞（转染效率达90%以上），在mRNA水平和蛋白水平均呈高表达，且可分泌到外周环境中。 3．BMP-2基因转染对hBMSC增殖、分化及VEGF表达的影响流式细胞仪检测表明，BMP-2基因转染后S期细胞比例增加，G1期细胞减少，说明细胞DNA的合成以及细胞的增殖活动加强。骨钙素免疫荧光、Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色和碱性磷酸酶活性测定结果显示，转基因表达的BMP-2促进了hBMSC向成骨细胞转化。VEGF原位杂交染色，图像分析系统测定平均染色灰度值，统计学结果表明BMP-2基因转染可上调细胞VEGF的表达，提示BMP-2可间接诱导血管再生。4．BMP-2基因治疗的组织工程骨体外构建制备去抗原牛松质骨（BCB）支架，植入小鼠双侧股四头肌肌袋内。免疫学MTT法检测表明BCB无明显抗原性；组织学观察见淋巴细胞浸润较少，证实其体内植入的安全性和良好的组织相容性。将Ad-BMP-2转染后的hBMSC种植到BCB支架中复合培养，扫描电镜见转基因细胞在材料表面分布均匀，贴附生长良好。能量谱仪检测到细胞部位含钙量较空白处明显增高。Western blot 检测到培养液上清中BMP-2的存在。表明转基因细胞可以在支架中生长增殖，并继续外源性分泌BMP-2，促进自身矿化成骨。用于体内植入的BMP-2基因治疗的组织工程骨构建成功。 <WP=97>二、BMP-2基因治疗的组织工程骨在裸鼠背部异位成骨将BMP-2基因治疗的组织工程骨移植到裸鼠背部皮下，实验分为5组：①Ad-BMP-2转染hBMSC＋BCB支架；②Ad-Lacz转染hBMSC＋BCB；③未转染细胞＋rh-BMP-2＋BCB；④未转染细胞＋BCB；⑤单纯BCB。4、8周处死取材。组织切片HE染色、扫描电镜和透射电镜观察新骨形成，骨钙素免疫组化染色检测宿主间充质细胞向成骨细胞的诱导分化。Y染色体探针荧光原位杂交法（FISH）追踪植入hBMSC的命运，观测其是否参与成骨。结果表明：（1）BMP-2基因治疗方式诱导成骨速率较快，而整合BMP-2蛋白组新骨形成则相对迟缓，血运相对较差，成骨受到明显影响。BMSC虽具有骨诱导潜能，然而成人来源的细胞单独应用，成骨作用极其微弱，表明BMP-2对于刺激hBMSC分化和诱导异位成骨起着至关重要的作用。（2）BMP-2诱导成骨方式以软骨化骨为主。新形成的骨组织含钙量较低，成熟的骨细胞栖居于骨陷窝内，并沿新形成的哈佛氏管伸出突起，而细胞外基质表达Ⅰ型胶原，从结构和功能上证明新形成的组织为骨组织。（3）BMP-2基因转染的hBMSC不仅作为生长因子的载体，而且直接参与成骨。（4）BMP-2可以诱导宿主间质细胞趋化、聚集，向成骨细胞、成软骨细胞转化。三、腺病毒介导的BMP-2体外基因治疗修复兔桡骨缺损分离培养兔BMSC，经BMP-2腺病毒载体转染后，与BCB支架复合，自体移植到1.5cm桡骨缺损处。实验分组同上。术后4、8、12周X光片和组织切片HE、甲苯胺蓝染色观察骨缺损修复，并同时采用图像分析系统测定新骨密度及新骨形成面积；免疫组化染色检测BMP-2分布及表达情况；墨汁灌注观测新生骨血运；生物力学测试骨修复12周后的机械强度。结果显示BMP-2基因治疗组：（1）4周X线片见移植骨大半呈密度增高的成骨影。8周，骨折线模糊，骨缺损初步修复。12周骨缺损修复完善，骨皮质连续，髓腔再通。（2）组织学观察见4周时支架降解吸收的同时被新生<WP=98>骨同步取代，可见软骨内骨化，骨软骨岛相互?