研究背景和目的肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)为世界范围内发病率第6位的癌症,为癌症致死原因的第3位。在发展中国家,HCC的主要风险是HBV的感染和黄曲霉素B1的摄入。在我国,约80%的肝癌患者伴有HBV感染。众所周知,肝细胞的坏死和持续增殖,炎症细胞的浸润导致的大量炎症因子和促纤维化因子的释放伴随着微环境的改变都在癌变中扮演了关键作用。在肝炎、肝硬化的进程中,常常出现伴有染色体变化的不典型增生结节,这些不典型增生结节可进展为肝癌的早期阶段。近年来针对HBV和HCV的抗病毒治疗,使肝硬化的治疗取得了巨大进展,相当程度上也减少了HCC的发生。针对HCC的研究也取得了许多进展,总生存率较前有了改善,但与其他恶性肿瘤相比,治疗效果仍不满意。因此,寻找到有效的抗肝纤维化的药物,阻断肝炎-肝硬化-肝癌的进程仍是国内外研究的热点和重点课题。近年来的流行病学研究发现他汀类的药物的使用能够减少肝癌的发病率。一项在糖尿病人群中的研究也发现,他汀类药物的使用与减少糖尿病人群中肝细胞癌的发病率显著相关。中国台湾的一项临床观察发现使用他汀类药物可能会降低HBV感染患者的肝癌发病率。他汀类药物是现在临床上较为广泛使用的降血脂药,为羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂。其作用原理是通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶(HMG-CoA还原酶),使细胞内羟甲戊酸代谢途径中止,导致细胞内的胆固醇合成减少,从而反馈性刺激肝细胞膜表面的低密度脂蛋白(LDL)受体数量增加、活性增强,从而使血清胆固醇清除增加、水平降低。一般认为,他汀类药物抗癌的作用机制是通过竞争性抑制HMG-CoA还原酶,使甲羟戊酸途径受阻,减少胆固醇合成的中间产物(类戊二烯衍生物),从而抑制肿瘤的发生、增殖及转移。随着近年来他汀类药物的广泛使用和研究的深入,发现他汀类药物还具有改善内皮功能、减轻炎症反应、抗凝、抗血小板等“多效性”的特点。他汀类药物的多效性为我们研究其抗肿瘤机制提供了新的思路。有研究显示,他汀类药物对HMG-CoA还原酶的抑制阻碍成纤维细胞的增殖和蛋白质合成,并减少促纤维化细胞因子在肝外组织的表达。体内研究显示他汀类药物可减轻四氯化碳和胆管结扎所致的肝纤维化,降低肝硬化导致的门静脉高压。由于肿瘤的发生和进展与微环境有着密切关系,因此,我们认为他汀类药物可能还通过其抗炎、抗纤维化的作用发挥抗肝癌作用。在本研究中我们设想利用二乙基亚硝胺诱导大鼠肝炎-肝硬化-肝癌模型,同时给予他汀类药物中常用的阿托伐他汀进行干预,观察阿托伐他汀对该过程的影响,并进行机制研究,为阿托伐他汀用于抗纤维化治疗及HCC防治的辅助治疗提供确实的理论基础。研究方法1、建立DEN诱导大鼠肝炎-肝硬化-肝癌模型。2、通过对肝炎期(4周)、肝硬化期(9周)各组肝脏标本、肝脏与体重质量比、血液生化检查、HE染色的观察,分析阿托伐他汀对DEN诱导大鼠肝炎期、肝硬化期的影响。3、通过对肝癌期(15周)各大鼠肿瘤发生率、肿瘤体积之和、肿瘤数量、肝脏与体重质量比、血液生化学检测及组织切片HE染色的观察,分析阿托伐他汀对DEN诱导肝癌的影响。4、通过天狼猩红染色观察肝组织内胶原纤维积累情况,分析阿托伐他汀对DEN诱导肝纤维化的影响。5、使用Illumina HiseqTM2000分别对NC、DEN、DEN+Ato三组肝硬化期(9周)的大鼠肝脏组织进行RNA-seq测序,并进行Pathway显著性富集分析。6、采用免疫组化方法,检测DEN诱导大鼠肝炎-肝硬化-肝癌模型各阶段组织中Ki67、TGF-beta、α-SMA蛋白表达情况。7、利用免疫组织化学方法,检测VEGFa蛋白在癌组织及癌旁组织的表达情况。8、采用MTT方法,检测阿托伐他汀在体外对HSC-T6细胞(大鼠星状细胞系)增殖活性的影响。9、采用流式细胞仪检测阿托伐他汀在体外对HSC-T6细胞(大鼠星状细胞系)凋亡的影响。10、利用RT-PCR方法,检测阿托伐他汀干预在乙醇刺激下T6细胞内Ki67、TGF-beta、PDGFb、α-SMA基因的mRNA水平。11、利用Western Blot (WB)方法,检测阿托伐他汀干预在乙醇刺激下T6细胞内TGF-beta、PDGFb、α-SMA蛋白表达情况。结果1、成功构建了DEN诱导大鼠肝炎-肝硬化-肝癌模型,成瘤率可达100%。2、阿托伐他汀具有显著减轻DEN所致的肝细胞水肿、脂肪变性、炎细胞浸润的作用。3、阿托伐他汀显著减少DEN诱导大鼠肝癌发生的数目和肿瘤负荷。4、阿托伐他汀可持续抑制DEN诱导大鼠肝癌模型的细胞外胶原纤维形成,从而阻止肝硬化发生。值得注意的阿托伐他汀减少肿瘤包膜,可能与阿托伐他汀减少了肝组织的纤维化有关。5、阿托伐他汀显著改善了肝硬化期大鼠的肝功能状况；在肝癌期仍可降低大鼠血清GGT水平。6、RNA-seq测序结果显示：阿托伐他汀可显著下调肝组织内PCNA、Mki67、 PDGFb、TGF-beta、CTGF、α-SMA的表达；Pathway显著性富集分析显示：TGF-beta信号通路可能在阿托伐他汀对DEN诱导SD大鼠肝硬化模型的保护作用中起着重要作用。7、阿托伐他汀可明显抑制DEN所致肝炎期、肝硬化期肝细胞的增殖和肝组织的再生。8、阿托伐他汀在肝炎期、肝硬化期均表现出明显的抑制TGF-beta表达的作用；在肝硬化期表现出抑制α-SMA表达的作用。9、阿托伐他汀显著减少癌旁组织内TGF-beta、α-SMA的表达；DEN+Ato组无肿瘤大鼠肝脏TGF-beta和α-SMA表达量最少,两者结果完全一致。10、阿托伐他汀显著减少癌和癌旁组织中VEGFa的表达。11、DEN+Ato组与DEN组相比,癌及癌旁组织中Ki67蛋白的表达未显示出显著差异。12、阿托伐他汀在体外可显著抑制HSC-T6细胞的增殖。13、阿托伐他汀在体外可显著诱导HSC-T6细胞的凋亡。14、阿托伐他汀可显著抑制乙醇活化后星状细胞TGF-beta的表达。结论本研究成功的构建了DEN诱导大鼠肝炎-肝硬化-肝癌模型。创新性地应用多种实验方法研究了阿托伐他汀在DEN诱癌过程中不同的病理阶段中的作用。我们的研究发现,在肝炎期,阿托伐他汀对肝细胞的保护作用有限,但阿托伐他汀具有较强的抗纤维化作用,在肝癌期能够显著减少肿瘤发生的数目、减少肿瘤负荷。阿托伐他汀可能主要是通过抑制星状细胞活化和增殖、促进其凋亡,从而持续抑制肝组织内TGF-beta的水平；继而调节基质微环境减少肿瘤的发生和发展。同时,阿托伐他汀可能还通过抑制肝细胞增殖,减少癌组织和癌旁组织中VEGFa的表达抑制肿瘤新生血管形成发挥抗肿瘤作用。该研究结果为阿托伐他汀抗纤维化的临床应用以及用于防治肝癌的辅助治疗提供了实验支持和理论依据。