蜈蚣醇提液的毒理学研究及对肝癌细胞株Bel-7402生物学影响背景与目的肝细胞癌（Hepatocelular carcinoma,HCC）是世界上常见的恶性肿瘤之一,临床预后很差。以手术为主的综合治疗是目前治疗肝癌的主要模式,但疗效尚不满意。所以寻求一种有效的治疗药物来提高肝癌的治疗效果,是有重要的意义。蜈蚣作为一种具有一定毒性的传统中药,在我国已经有两千年的使用历史。近年来,蜈蚣抗肿瘤的研究有少量的报道,机理不甚明确。因此,我们以蜈蚣醇提液作为一种抗肿瘤药物,通过毒理学方面的研究,寻求其安全有效的剂量。有研究发现MAPK作为信号从细胞表面到细胞核内部的一条重要的传递途径,可能参与了HCC的发生与发展。本研究以蜈蚣醇提液作用于肝癌细胞株Bel-7402,观察治疗的效果和毒性,并检测MAPK通路的ERK、JNK和p38基因的表达情况及蛋白质活性来探讨蜈蚣醇提液作用机制,为蜈蚣醇提液的临床治疗提供理论基础。第一章蜈蚣醇提液的毒理学研究目的:本实验通过蜈蚣醇提液对昆明小鼠及SD大鼠的动物实验,对蜈蚣醇提液进行毒理学方面的研究,为寻求安全有效的治疗剂量提供理论依据。方法:1急性毒理学实验取健康昆明种小鼠40只,雌雄各半,按体重随机分为蜈蚣醇提液治疗组和对照组。蜈蚣醇提液治疗组按80000mg/kg体重/天,以最大耐受剂量,灌胃方式给药1次,观察1周,记录动物死亡数。方法2骨髓微核实验取健康昆明种小鼠50只,雌雄各半,随机分为5组:阴性对照组、环磷酸胺阳性对照组、为蜈蚣醇提液10000、20000、40000mg/kg灌胃给予,于第七次给药后24h进EEC的骨髓微核实验。3 30天喂养试验取健康SD大鼠80只,雌雄各半,随机分为4组:阴性对照组、蜈蚣醇提液组（分别给蜈蚣醇提液2500mg/kg、5000mg/kg、10000mg/kg）。SD大鼠正常喂养,定期称体重,用药30天后和停药14天处死,取肝、肾、肺、心、睾丸、卵巢称重,主要脏器实重及计算脏器系数的变化,测量血常规和血清生化等指标。标本HE染色,进行病理形态学观察。4丙二醛（MDA）的测量:采取用药30天后和停药14天各组大鼠左肝组织匀浆,测量其中的丙二醛（MDA）含量。结果:急性毒理学实验小鼠的MTD为80000mg/kg体重/天,无一死亡。骨髓微核实验结果表明:蜈蚣醇提液40000mg/kg体重组与阳性对照组微核率高于阴性对照组（P＜0.05）,蜈蚣醇提液10000mg/kg、20000mg/kg体重组微核率与阴性对照组相比均无显著性差异（P＞0.05）。蜈蚣醇提液作用后各组大鼠体重变化、大鼠脏器系数、大鼠血常规结果与对照组比较未见显著性差异（P＞0.05）。蜈蚣醇提液作用30天后的10000mg/kg体重组中AST、ALT的值均明显高于阴性对照组,差异有显著性,（P＜0.01）。蜈蚣醇提液作用30天后,10000mg/kg体重组肝脏病理切片光镜下可见部分大鼠肝血窦扩张充血,可见少量的炎性细胞浸润和中央静脉淤血,汇管区可见炎性细胞浸润。停药14天后,可恢复。蜈蚣醇提液作用大鼠后肝组织中MDA含量结果表明:蜈蚣醇提液作用大鼠30天后10000mg/kg体重组MDA含量与空白对照组比较有差异性（P＜0.01）;而2500mg/kg体重、5000mg/kg体重组与空白对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。结论:小鼠蜈蚣醇提液的MTD:80000mg/kg体重/天,40000mg/kg蜈蚣醇提液具有一定的致突变性;10000mg/kg蜈蚣醇提液可能通过脂质过氧化及MDA而使肝细胞损伤,对肝脏有一定的毒性,蜈蚣醇提液属于一种低毒药物。第二章蜈蚣醇提液对肝癌细胞株Bel-7402生物学行为影响目的:研究蜈蚣醇提液对肝癌细胞株Bel-7402的毒性及敏感性作用,为肝癌的临床治疗提供理论依据。方法:体外培养肝癌细胞株Bel-7402,蜈蚣醇提液（64mg/ml、32mg/ml、16mg/ml、8mg/ml、4mg/ml及2mg/ml）予以干预,通过MTT实验,细胞的药物浓度—时间生长曲线研究其对肝癌细胞株Bel-7402和正常人肝细胞L-02的敏感性;Hoechst 33258染色试剂染色观察蜈蚣醇提液处理Bel-7402细胞后的形态变化;利用倒置光学显微镜观察细胞形态的变化;流式细胞仪检测药物治疗组早期凋亡率。结果:1 MTT法揭示各浓度蜈蚣醇提液对人肝癌细胞Bel-7402生长均有抑制作用。蜈蚣醇提液在64mg/ml、32mg/ml、16mg/ml、8mg/ml、4mg/ml及2mg/ml下对Bel7402的抑制率依次为（80.59±2.95）%、（71.96±3.36）%、（64.57±2.93）%、（53.35±1.85）%、（33.77±0.88）%、（6.37±0.44）%,IC₅₀为7.83mg/ml。2细胞生长曲线图显示Bel-7402,OD值与蜈蚣醇提液浓度及药物作用时间相关。治疗组浓度在4mg/ml时,OD值亦先增加,在用药2天后Bel-7402 OD值开始减少;浓度在8 mg/ml、16mg/ml时,用药1天内OD值就显著减少（p＜0.01）。4mg/ml、8mg/ml蜈蚣醇提液对正常人肝细胞株L-O2的增殖没有明显的影响（P＞0.05）,16mg/ml蜈蚣醇提液在用药5天内对L-O2细胞的增殖没有明显的影响（P＞0.05）,在第6、7天,L-O2细胞的增殖开始减缓,与对照组比较有差异性（p＜0.01）。3光镜下见蜈蚣醇提液作用48h后,浓度为2、4mg/ml对Bel-7402细胞抑制作用很弱,浓度在8mg/ml、16mg/ml时,Bel-7402活细胞数减少,细胞抑制作用明显增强,细胞形态变圆变小,浓度在32mg/ml以上时,见细胞大片坏死,有较多的不规则细胞碎片,培养瓶中坏死脱落细胞增多。Hoechst 33258染色试剂染色观察8、16mg/ml治疗组细胞密度增高,染色质凝集固缩,染色质边集,核固缩及核碎裂。4流式细胞仪检测发现:细胞凋亡率:24小时后对照组的自发凋亡率（2.37±0.37）%,浓度4mg/ml时为（4.99±0.76）%,8mg/ml时为（10.59±1.11）%,16mg/ml时为（15.80±1.46）%,各浓度组间差异明显（p＜0.05）;48小时后对照组的自发凋亡率（3.44±0.45）%,浓度4mg/ml时为（5.87±0.93）%,8mg/ml时为（12.48±1.75）%,16mg/ml时为（20.29±1.90）%,各浓度组间差异明显（p＜0.01）;在8mg/ml、16mg/ml浓度组,24小时的细胞凋亡率明显低于48小时的,差异显著（p＜0.01）;在4mg/ml浓度组,24小时的细胞凋亡率与48小时的细胞凋亡率无明显差异性（P＞0.05）。结论:1蜈蚣醇提液能抑制人肝癌细胞Bel-7402的增殖,且抑制作用呈剂量和时间依赖效应;2蜈蚣醇提液蜈蚣醇提液在8mg/ml时对L-02细胞增殖没有明显的影响,对Bel-7402细胞的增殖有明显的抑制作用,诱导其早期凋亡。第三章蜈蚣醇提液对肝癌细胞株Bel-7402凋亡机制的研究目的:研究蜈蚣醇提液对肝癌细胞株Bel-7402凋亡的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:将蜈蚣醇提液（4mg/ml、8mg/ml、16mg/ml）作用于Bel-7402肝癌细胞48h,采用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测细胞内ERK、JNK、p38、p53、Bcl-2、Bax及caspase-3表达的改变。并将16mg/ml浓度的蜈蚣醇提液分别与MAPK的抑制剂（ERK抑制剂PD98059、JNK抑制剂SP600125、p38抑制剂SB203580）联合作用于Bel-7402细胞,Western blot法检测细胞内p-ERK1/2、p-JNK1、p-p38蛋白表达的变化。以上实验步骤重复三次结果:1.JNK、p53、Bax和caspase-3在蜈蚣醇提液各治疗组的表达和对照组相比明显上调（P＜0.01）,ERK和Bcl-2的表达则下调（P＜0.05）。p38的表达在蜈蚣醇提液各治疗组和对照组间无明显差异性（P＞0.05）。2.蜈蚣醇提液各治疗组p-ERK1/2的表达水平相对于对照组明显下调（P＜0.01）,抑制剂组p-ERK1/2较对照组明显下调（P＜0.01）;蜈蚣醇提液各治疗组p-JNK1的表达水平相对于对照组明显上调（P＜0.01）,抑制剂组p-JNK1蛋白的表达较等量蜈蚣醇提液组明显下降,但高于对照组,有显著性差异（P＜0.01）;蜈蚣醇提液各治疗组p-p38的表达水平相对于对照组无明显差异性（P＞0.05）,抑制剂组p-P38蛋白的表达较对照组明显下调（P＜0.01）。3.相关性分析结果:ERK在蜈蚣醇提液各治疗组的表达和p53、Bax和caspase-3在蜈蚣醇提液各治疗组的表达呈负相关（r=-0.965,P＜0.01;r=-0.974,P＜0.01;r=-0.974,P＜0.01）;和Bcl-2的表达呈正相关（r=0.946,P＜0.01）。JNK在蜈蚣醇提液各治疗组的表达和p53、Bax和caspase-3在蜈蚣醇提液各治疗组的表达呈正相关（r=0.913,P＜0.01;r=0.931,P＜0.01;r=0.937,P＜0.01）;JNK与Bcl-2的表达呈负相关（r=-0.883,P＜0.01）。结论:1蜈蚣醇提液可能通过阻断ERK1/2通路和激活JNK1通路来抑制Bel-7402的增殖,诱导其凋亡。2.ERK1/2通路抑制、JNK1通路激活后可能诱导蜈蚣醇提液各治疗组p53、Bax和caspase-3的表达上调和Bcl-2的表达下调,提示蜈蚣醇提液可能通过多途径抑制Bel-7402生长,诱导其调亡。