1、目的与意义中药是中华民族的瑰宝,为中华民族的健康与繁衍做出了不可磨灭的贡献。中药成分复杂,既包括主要有效成分也包括一些辅助治疗成分和无效成分。区别于一般的化学药物,中药依靠多种成分共同发挥作用,因此其质量控制与单一成分化学药物质控模式存在着本质的区别。依据一系列质量标准规范,对中药形成过程中的每个环节进行质量监测、评价与控制。如何对其进行更好地质量控制是我们现今面临的一大挑战,随着现代化学分析技术的不断进步,各种各样的分析方法被运用于中药饮片及其复方的质量控制。凉膈散是出自宋代《太平惠民和剂局方》中的经方,具有清热解毒作用,用于治疗肺炎、支气管炎、鼻窦炎、头痛、中风、风疹等疾病。本方的单味药分别具有导泻、利尿、利胆、抗炎和抗菌等作用。急性肺损伤是各种直接或间接因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤,造成弥漫性肺间质及肺泡水肿,多种炎症介质的释放,引发肺内过度失控的炎性反应,最终导致的急性低氧性呼吸功能不全,是临床常见的呼吸系统危重病之一。中西医结合治疗治疗急性肺损伤具有一定的优势与特色,以往研究表明凉膈散对内毒素致大鼠急性肺损伤有一定改善作用。本实验研究凉膈散汤剂指纹图谱,并对指纹色谱峰所代表的化学成分进行归属,建立同时测定方中连翘酯苷A、黄芩苷、大黄素含量的方法,为该方的物质基础研究及质量控制提供了科学依据,形成该方整体特征的质量评价方法。同时运用该方水提液浓缩干燥粉末以及方中主要成分连翘酯苷A和黄芩苷进行细胞水平的初步抗炎实验研究。2、实验方法2.1凉膈散汤剂指纹图谱研究及其主要成分连翘酯苷A、黄芩苷、大黄酸的含量测定采用HPLC法,二极管阵列检测器(DAD), Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱(250mm×4.6mm.5μm),以甲醇-0.1%磷酸水溶液为流动相,二元梯度洗脱；流速1mL/min;柱温38℃,检测波长235nm；进样量10μL；检测时间85min。以黄芩苷作为参照峰,测定10批凉膈散汤剂及各缺味药材阴性对照色谱图,对凉膈散汤剂整体质量进行分析,运用指纹图谱相似度评价软件评价十批药材的相似度,并对全方特征峰进行药味归属分析,在一定程度上阐述了凉膈散汤剂的物质基础。在此色谱条件下同时测定5批药材中连翘酯苷A、黄芩苷、大黄酸的含量,建立其含量测定方法,为凉膈散汤剂质量标准的建立提供参考。2.2凉膈散、黄芩苷、连翘酯苷A对RAW264.7细胞毒性研究RAW264.7细胞用低糖DMEM培养基在37℃、5%CO2的环境下培养,待细胞生长至90%时,胰酶消化1：3传代。取对数生长期细胞进行实验,调整细胞浓度为1×104/孔接种于96孔板中。实验分为正常对照组和给药组,给药组给予不同浓度连翘酯苷A、黄芩苷、凉膈散溶液,MTT法测定不同浓度凉膈散、黄芩苷、连翘酯苷A对RAW264.7细胞细胞毒性大小,通过OD值计算细胞存活率,确定合适的细胞给药浓度；实验分为正常对照组、模型对照组和LPS+给药组,MTT法测定OD值,计算细胞存活率,检测药物对细胞增殖情况的影响。2.3凉膈散、黄芩苷、连翘酯苷A对LPS刺激后RAW264.7细胞炎症因子分泌的影响采用LPS处理小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞,建立细胞炎症模型,实验分为正常对照组、模型对照组和LPS+给药组,药物处理24h后,收集细胞培养上清,NO检测试剂盒检测上清中NO水平,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测上清中TNF-α、IL-6含量。2.4统计学分析采用SPSS13.0统计软件。实验数据采用均数±标准差(X±s)表示。结果比较运用单因素方差分析(One-way ANOVA),组间多重比较方差齐时采用LSD法,不齐时用Dunnett’s T3。以P<0.05为差异有统计学意义。3、实验结果3.1建立了凉膈散汤剂HPLC指纹图谱,10批样品的相似度均在0.9以上。标定了22个共有峰,均归属到各药材,其中8个色谱峰可明确其化学成分。同时建立了同时测定凉膈散汤剂中主要成分连翘酯苷A、黄芩苷、大黄酸含量的方法,在该方法条件下,连翘酯苷A、黄芩苷、大黄酸分别在10-160μg/mL、20.5-328μg/mL、3.125-50μg/mL范围内线性关系良好,平均回收率(n=6)分别为98.8%、107.1%、102.5%。3.2MTT法检测不同浓度凉膈散、黄芩苷、连翘酯苷A对RAW264.7细胞毒性大小,给药组和正常对照组存活率相比P<0.05,具有统计学差异,细胞存活率呈剂量依赖关系,最终确定给药浓度为连翘酯苷A(100、10、5μg/mL)、黄芩苷(40、20、lμg/mL)、凉膈散(40、10、1μg/mL)。给予LPS(lμg/mL)刺激诱导RAW264.7细胞炎症模型,上述浓度给药后,MTT法检测OD值,正常对照组和模型对照组相比P<0.05,具有统计学差异,根据存活率可知LPS对RAW264.7细胞具有增殖作用；黄芩苷和凉膈散给药组和模型对照组相比P<0.05,具有统计学差异,根据存活率表明药物对于LPS对细胞的增殖作用有抑制效果,且呈剂量依赖关系。连翘酯苷A给药组和模型对照组相比,P<0.05,具有统计学差异,由存活率可知在一定浓度范围内药物对细胞具有一定增殖作用。3.3给予LPS刺激诱导RAW264.7细胞炎症模型,模型对照组细胞培养上清中NO水平显著高于正常对照组,给药后三种药物高、中、低剂量组均能显著降低细胞培养上清中NO水平；模型对照组细胞培养上清中IL-6、TNF-α水平显著高于正常对照组,给药后三种药物高、中、低剂量组均能显著降低细胞培养上清中IL-6的水平；连翘酯苷A高剂量组,黄芩苷高、低剂量组,凉膈散高、中剂量组TNF-α水平较模型对照组显著降低。4、研究结论4.1建立了凉膈散汤剂HPLC-DAD指纹图谱,该方法准确稳定、重复性好,体现了凉膈散汤剂组分的整体特征,提高了对中药复方质量控制的专属性。4.2建立了同步测得凉膈散汤剂中连翘酯苷A、黄芩苷、大黄酸的含量的方法,该方法稳定,线性关系及重现性良好,可作为凉膈散汤剂的质量控制指标之一,为进一步研究其物质基础和作用机理打下基础。4.3通过MTT实验可知连翘酯苷A、黄芩苷、凉膈散能降低LPS对RAW264.7细胞的增殖作用。4.4LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型成功后,炎症因子IL-6、TNF-α、NO水平显著上升,通过给予药物连翘酯苷A、黄芩苷、凉膈散干预后,能显著降低其水平,初步表明了连翘酯苷A、黄芩苷、凉膈散的抗炎作用机制。