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研究背景随着人们生活方式的改变，特别是高脂高糖饮食，冠心病的发病率急剧上升，急性冠状动脉综合征(Acute coronary syndrome，ACS)作为冠心病的一种急危重症，严重危害了人类的健康。大量文献报道，冠状动脉内斑块的形成及其稳定性是决定ACS是否发生的重要因素，因此，ACS发生形成的重要基础是不稳定斑块（unstableplaque，UP），并且UP的破裂及血栓形成是ACS最终引起恶性心血管事件发生的主要原因。所以，为了临床防治ACS，提高患者生存质量；改善疾病预后，降低其死亡率，对不稳定斑块的形成以及破裂的研究至关重要。然而，目前斑块“不稳定性”的具体机制仍不明确。众多研究显示，巨噬细胞凋亡是造成动脉粥样硬化斑块不稳定的重要因素，在晚期动脉粥样硬化中，巨噬细胞凋亡与内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)的发生密切相关。ERS是指某些原因引起的细胞内质网内稳态失衡、生理功能紊乱的过程。传统观点及本课题组前期的研究均表明持久或和较为严重的ERS会诱导凋亡瀑布反应，促进CHOP、JNK等分子表达和活化，最终引起细胞凋亡；然而适度的ERS可促进错误折叠和未折叠蛋白质降解等方式使应激得到缓解。最新研究报道发现，适度的ERS可通过激活自噬，减少心肌组织的缺血再灌注损伤。那么适度ERS对AS有何影响目前尚不清楚。自噬(Autophagy)是由溶酶体系统降解长半衰期蛋白和细胞器的代谢途径，可被饥饿、细胞分化和正常的生长调节激活，主要为了保持细胞内环境稳定和存活。以往研究表明，激活巨噬细胞自噬显著增加动脉粥样硬化斑块的稳定性，然而，在动脉粥样硬化的发展过程中，内质网应激和自噬的关系以及最终对斑块稳定性的影响尚不清楚。衣霉素是内质网应激的一种明确的激活剂，因此，我们以ApoE基因敲除（ApoE-/-）动脉粥样硬化小鼠为研究对象，建立不稳定动脉粥样硬化斑块模型，观察不同剂量衣霉素引起的内质网应激对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响，且观察内质网应激和自噬的状态。体外应用不同剂量衣霉素对巨噬细胞进行干预，检测不同程度内质网应激对泡沫细胞形成的影响以及自噬在其中可能起到的作用。研究目的1．体外构建ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化不稳定斑块模型，观察不同剂量衣霉素对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响，且观察内质网应激和自噬的状态；2．离体构建泡沫细胞模型，模拟动脉粥样硬化斑块形成过程，观察不同剂量衣霉素对泡沫细胞形成的影响；3．探讨不同剂量衣霉素影响泡沫细胞形成的机制，尤其是自噬在其中可能起到的作用实验方法1．取6-8周的ApoE-/-小鼠40只，给予高脂喂养1周后，随机将小鼠分为：对照组和手术组。手术组小鼠行右侧颈总动脉套管术（Perivascular carotid collarplacement，PCCP），术后继续高脂喂养9周。9周末取对照组和手术组小鼠颈动脉，H&E染色观察小鼠颈动脉斑块形成情况。2．为了观察不同剂量衣霉素对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响，将小鼠分为四组：正常对照组、单纯PCCP组、小剂量衣霉素组和大剂量衣霉素组。正常对照组和单纯PCCP组给予生理盐水腹腔注射，小剂量衣霉素组和大剂量衣霉素组分别给予小剂量衣霉素、大剂量衣霉素腹腔注射。2周后，处死小鼠，通过H&E染色观察颈动脉斑块形态，油红O染色观察斑块内脂质聚集，抗巨噬细胞免疫组化染色观察斑块内巨噬细胞聚集，Western-blot检测内质网应激标志蛋白GRP78和自噬标志蛋白Atg7、p62的表达水平。3．体外培养巨噬细胞RAW264.7，建立巨噬细胞泡沫细胞模型。为了观察不同剂量衣霉素对巨噬细胞的影响，将细胞随机分为4组：（1）正常对照组，（2）ox-LDL组，（3）ox-LDL+0.1TM组，（4）ox-LDL+1.0TM组；进而深入研究小剂量衣霉素影响泡沫细胞形成的具体机制及其与自噬的关系，将细胞随机分为5组：（1）正常对照组，（2）ox-LDL组，（3）ox-LDL+0.1TM组，（4）ox-LDL+0.1TM+3-MA组，（5）ox-LDL+Rapa组；分别通过油红O染色检测泡沫细胞含量，TUNEL检测巨噬细胞凋亡以及Western-blot检测内质网应激标志蛋白GRP78和自噬标志蛋白Atg7、p62的表达水平。实验结果1．行PCCP手术的ApoE-/-小鼠通过高脂喂养9周后，H&E染色结果显示：手术组小鼠颈动脉内发现内部脂质池较大的动脉粥样硬化斑块，而对照组小鼠无斑块形成，其颈动脉管壁光滑。以上表明建模成功。2． H&E染色结果显示：与单纯PCCP组和大剂量衣霉素组相比，小剂量衣霉素组颈动脉腔内的斑块脂质池减少，斑块结构较为完整且相对稳定；油红O染色结果显示：小剂量衣霉素组斑块内脂质含量显著降低（P <0.05vs单纯PCCP组和大剂量衣霉素组）；巨噬细胞免疫组化染色显示：与单纯PCCP组和大剂量衣霉素组相比，小剂量衣霉素组斑块内巨噬细胞的含量显著降低（P <0.05），Western-blot结果显示：小剂量衣霉素干预诱导的一定程度的内质网应激可以适度上调自噬（P <0.05vs单纯PCCP组和大剂量衣霉素组）。3．油红O染色与TUNEL结果显示：50mg/L的ox-LDL可以成功模拟巨噬细胞泡沫化，发现大量富含红色脂滴颗粒的巨噬细胞，并且诱导了巨噬细胞凋亡(P <0.01vs正常对照组)，而小剂量衣霉素干预后，巨噬细胞内红色脂滴颗粒显著减少且巨噬细胞凋亡减少(P <0.01vs ox-LDL)，而小剂量衣霉素的作用被自噬抑制剂3-MA抑制自噬后显著减弱(P <0.01vs0.1TM+ox-LDL)，但自噬诱导剂雷帕霉素又可模拟小剂量衣霉素的保护作用。4． ox-LDL干预细胞后，GRP78和p62蛋白表达水平上调，Atg7蛋白表达水平下调(P <0.05vs正常对照组)。小剂量衣霉素干预后，GRP78和p62蛋白表达水平显著下调，Atg7蛋白表达水平显著升高(P<0.05vsox-LDLand1.0TM+ox-LDL)。小剂量衣霉素的作用由于自噬抑制剂3-MA的加入，被显著减弱，Atg7蛋白表达水平下调，p62蛋白表达水平相应上调（P<0.05vs0.1TM+ox-LDL），而GRP78的蛋白表达水平变化不明显；自噬诱导剂Rapa干预后p62蛋白表达水平显著下调、Atg7蛋白表达水平上调，GRP78蛋白表达无显著差异。结论1．成功构建了不稳定性较高的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块模型；2．小剂量衣霉素预处理ApoE-/-小鼠可以减小颈动脉腔内的斑块脂质池、显著降低斑块内脂质含量和巨噬细胞数量，诱导了适度内质网应激，同时自噬上调，一定程度稳定了动脉粥样硬化斑块。3．小剂量衣霉素可以抑制ox-LDL导致的巨噬细胞泡沫化及凋亡，激活一定程度内质网应激，且自噬上调；4．小剂量衣霉素的作用机制是诱导适度内质网应激，进而激活适度自噬，从而有助于稳定动脉粥样硬化斑块。