抗T-2毒素和脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素的抗体制备和T-2毒素酶联免疫分析检测方法的建立

来源 :华中农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:alex_tan01
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单端孢霉烯族类毒素普遍存在于自然界中,主要由真菌产生。粮食在收获,运输,储存中被此类毒素污染的机率很高,带来了不可忽略的食品安全隐患。因此,建立一种方便、快速、可靠的检测方法来检测食品及谷物中毒素的含量是非常必要的。本研究的两种毒素T-2及DON (deoxynivalenol)毒素,分别是单端孢霉烯族类毒素A类和B类中重要的毒素,本文诣在建立其以ELISA为主的免疫学检测方法。(1)从禾谷镰刀菌的大米发酵产物中分离纯化到纯度为97.7%的DON毒素,将高速逆流色谱与高效液相色谱法有效地结合,从300 g大米发酵产物中获得8 mgDON毒素,用于和载体蛋白偶联。(2)通过DMAP (dimethylamiopryidine)催化法,合成了T-2-HS,通过碳二亚胺法与载体蛋白结合得到3种完全抗原,分别为T-2-HS-BSA, T-2-HS-OVA, T-2-HS-KLH,质谱鉴定其中的T-2-HS-BSA的偶联比为2.63。以T-2-HS-BSA免疫小鼠获得了高效价的抗T-2毒素多克隆抗体,建立了T-2毒素的间接竞争酶联免疫吸附检测方法。条件为:以20μg/mL的T-2-HS-KLH为包被原,封闭液为0.5%的卵清蛋白,多克隆抗体为一抗,标准品T-2毒素为竞争毒素。该方法的检测限为0.12μg/mL,线性范围0.28-30.84μg/mL, IC50值为1.45μg/mL,样品加标回收率为92.0%-104.6%,变异系数为15.1%-34.0%。(3)采用DMAP催化法,成功将DON的三个羟基位点乙酰化,并成功合成了混合免疫原DON-(HS)n-BSA及包被原DON-(HS)n-KLH,质谱结果显示免疫原的偶联效果较佳,免疫动物后获得了抗DON的多克隆抗体。
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