研究背景和目的:脓毒症患者最常见的感染源来自腹腔,研究表明因严重腹腔感染导致脓毒症而引起的致死率仍在20%以上,是临床工作面临的一大难题(1)。近年研究表明脓毒症时,对机体的损害不再单纯局限于细菌毒素作用,主要是随后引起的过度炎症反应以及免疫功能损害,在病情发展过程中起着非常重要的作用。感染时机体的病理生理改变不断变化甚为复杂,直至感染被完全控制或机体的生理功能完全停止,这种情况才能得以缓解。与此同时,机体相继出现的免疫反应也伴随机体病理生理转变而不断改变,可发现致炎与抑炎因子不停的增长或减退,最终导致机体免疫功能障碍。虽然近年来各种新的诊治手段不断出现,但其死亡率从80年代起仍徘徊在20-40%。其主要死亡原因为腹腔感染而后诱发脓毒症(Sepsis),后者多早期出现全身炎症反应综合症,常进展为多脏器功能障碍综合症(MODS)和多器官功能衰竭(MOF),是人类死亡的主要原因之一。国外流行病学调查显示,美国每年约有750,000名脓毒症患者,总医疗费用高达167亿美元,且至少210,000例死亡,占总死亡人数的9%,脓毒症的死亡率己超过急性心肌梗死,成为临床第三大死因(2-4)。在欧洲,脓毒症的病死率亦高达27%(5)。根据我国近期的一项流行病学调查结果显示,我国临床患者脓毒症的发病率和死亡率也接近发达国家水平(6)。以上数据显示,尽管随着近年来各项先进诊治仪器设备不断出现,现代医疗技术、重症监护水平和支持治疗明显提高,但脓毒症居高不下的致死率、致残率并未得到遏制。目前很少有特异性针对性的治疗性药物,因此针对脓毒症的救治现状迫切需要引起广大科研人员的重视,进一步了解脓毒症的病理生理机制,寻找出有效的药物治疗靶点,改善救治现状。根据1991年危重病学会与美国胸腔外科讨论的定义,脓毒症是由微生物所引起的机体过度炎性反应。以前多认为脓毒症是主要由G-菌引起的,因而许多研究都针对G-菌感染进行展开。但根据近二十年研究发现,G+菌才是严重脓毒症的主要原因,且近年呈不断上升趋势,但研究相对甚少。在脓毒症患者中,已分离出的细菌有金黄色葡萄球菌,化脓性链球菌,克雷伯杆菌,大肠杆菌和铜绿假单胞菌,特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,作为典型的G+菌,已在临床感染中构成威胁,令人注目。作为G+菌细胞壁主要致病成分的肽聚糖(peptidoglycan-PGN),在G-菌的细胞壁亦有表达。因此结合临床致病情况,相对作为G-菌细胞壁的特有成分的脂多糖而言,针对肽聚糖的研究显得更具研究价值与研究意义,但目前针对肽聚糖的研究甚少。脓毒症具有极其复杂的病理生理机制,其发生、发展过程与感染、炎症、免疫和凝血功能障碍等因素密切相关。近年研究表明,脓毒症时机体表现出的不仅是过度炎症反应,更是一种极为复杂的免疫功能紊乱状态,而以往研究对此关注较少。人们逐渐认识到机体感染的细菌本身不直接引起机体致死性组织损伤和休克,而是通过病原体表面的多种成分,如肽聚糖(peptidoglycan,PGN)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、细菌脂蛋白(bacterial lipoprotein,BLP)、磷壁酸(lipotechoicacid,LTA)、甘露糖等为代表的病原体相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMP),PAMP 可与单核/巨噬细胞膜上的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)结合,激活下游多条信号通路,引起免疫细胞活化,释放多种细胞因子和炎症介质。正常状态下机体内的促炎因子与抑炎因子始终处于平衡状态,若促炎-抗炎自稳失衡,则将引起持续不受控的炎症反应,炎症介质过度释放,或引起免疫细胞和组织损伤,进而出现抗原递呈功能受抑制、吞噬杀菌活性减弱等免疫麻痹现象,大大减弱机体对外来侵袭物的抗御反应,最终导致器官功能障碍甚至衰竭。因此,炎症和免疫麻痹在脓毒症的发生、发展和转归过程中起关键作用,亦是目前治疗脓毒症的重要切入点。基于早期对脓毒症病理生理过程的认识局限,学者们认为脓毒症治疗成功的关键仅限于能否有效抑制促炎介质释放,阻断促炎细胞因子的反应网络,治疗策略一直仅针对促炎因子,因此这促使人们致力于细胞因子拮抗剂的研究。人们曾研发出多种细胞因子的拮抗剂,如抗TNF-α抗体、IL-1受体拮抗剂、抗内毒素抗体、磷脂酶A2拮抗剂、抗氧化剂、PAF拮抗剂、皮质激素、γ一干扰素等治疗,尽管在体外和动物实验中能有效地治疗脓毒症,但在临床病人中未能提高治愈率及生存率。目前尚无一种有效的细胞因子拮抗剂应用于临床治疗脓毒者功能。究其原因,可能是由于绝大多数细胞因子合成、释放较早,治疗时间窗相对较早,难以把握,因而不能很好的抓住最佳治疗时机,从而限制了炎症因子拮抗剂在临床中的使用。这也提醒广大科研工作者寻求其他更有效的治疗靶点改善脓毒症的救治现状。随着对脓毒症病理生理过程的进一步深入认识,人们发现脓毒症中后期的免疫抑制状态与过度炎症反应作用一样,在脓毒症发病过程中起着举足轻重的作用,由于免疫功能抑制状态相对发生较晚,使之成为可能的临床治疗契机,但其具体作用机制并不十分清楚。因此针对免疫功能抑制机制的相关研究越来越被研究者所重视。对脓毒症发病机制的深入分析我们发现,免疫细胞(如单核/巨噬细胞)在病原体介导脓毒症中引起的过度炎症反应及免疫抑制均具有重要作用,而近来的研究也证实,单核/巨噬细胞的异常活化是脓毒症的早期典型特征,因此我们认为深入研究脓毒症中的单核/巨噬细胞的功能作用机制具有重要意义,以期通过调整单核/巨噬细胞功能作用而达到改善过度炎症反应和免疫抑制双重作用,进而寻求更有效的药物治疗靶点。免疫的关键是激活巨噬细胞。巨噬细胞是脓毒症发病机制中的重要始动因素,作为固有免疫反应中的抗感染细胞及特异性免疫中的关键抗原呈递细胞,其功能变化在脓毒症免疫调节过程中起着重要作用。经典活化巨噬细胞(M1型)具有清除微生物及促炎作用;旁路活化巨噬细胞(M2型)巨噬细胞则具有很强的免疫调节及组织修复能力,但其杀灭微生物的功能较弱。巨噬细胞功能和炎症与免疫功能均息息相关,因此巨噬细胞功能异常,是导致脓毒症中免疫功能状态异常的重要原因之一。大量研究已证实,在脓毒症的发生发展过程中,免疫细胞调亡,包括巨噬细胞、单核细胞、淋巴细胞、NK细胞、树突状细胞等发生凋亡,是一种损伤性因素,可以导致免疫功能低下及终末脏器损害甚至死亡。究其原因是由于免疫抑制状态导致机体免疫系统对原发感染和继发感染控制失败,从而引起死亡。已证实脓毒症导致的巨噬细胞凋亡,引起其细菌清除能力和炎症细胞因子释放能力下降,是脓毒症导致死亡的重要原因之一。而拮抗免疫细胞的凋亡,可以显著改善脓毒症患者的预后。这些研究提示我们,针对改善免疫细胞功能进行诊治,为脓毒症治疗提供了新的思路。目前已有学者针对脓毒症中免疫细胞凋亡进行相关研究,并取得了一些有效成果。目前已知的广泛存在的细胞死亡程序主要是凋亡和坏死,而其他的一些细胞死亡程序,如焦亡和胀亡等也在疾病的发生发展过程中起着非常重要的作用。基于我们的前期研究也发现,除了凋亡、坏死之外,焦亡也被发现在脓毒症中被激活,但具体作用极其机制仍不太明确。焦亡细胞的生物学特征是依赖于半胱天冬氨酸蛋白酶-1(Cysteine aspartate-specific protease-1,caspase-1),最终导致细胞溶解并释放细胞内容物,伴随着大量炎症因子的产生,诱发炎症反应。焦亡不但发生在感染性疾病,还广泛参与动脉粥样硬化、急性脑缺血、帕金森症等疾病的发生发展。研究发现,在感染过程中,适度的细胞焦亡可以通过细胞降解、消失,一方面可使病原体失去赖以生存的生活环境,另一方面也可以使病原体暴露于细胞外,从而有利于其他巨噬细胞识别清除。然而细过度的胞焦亡也会对机体产生一些负面影响。由于发生焦亡的细胞会在细胞膜上形成小孔,使细胞膜失去完整性,甚至会发生细胞崩解,从而使细胞浆内容物释放到细胞外环境中。而释放到细胞外的细胞浆内容物通常是有效地(damage-associated molecular pattern,DAMPS),例如 HMGB1(high mobility group box 1)、ATP、热应激蛋白及DNA核染色质复合物等,它们可以通过激活相应的受体促使炎症因子的产生和释放。同时细胞焦亡时生成的产物IL-1β和IL-18,均参与到自分泌和旁分泌信号通路中,可以募集、激活其他免疫细胞、释放免疫刺激因子,诱导炎症因子、趋化因子、黏附分子等的合成,级联放大炎症反应。过量的细胞焦亡释放大量的DAMPS,可能会对机体造成病理组织学损伤。并且大量巨噬细胞发生焦亡,使得免疫细胞不能进行有效克隆与增殖,机体则难以通过免疫细胞对病原体产生有效的免疫应答,这也可能是导致机体出现免疫抑制的原因之一。细胞焦亡在免疫应答中的作用尚不明确,细胞内通路目前还有很多不为人知。一个焦亡的细胞可能由于细胞通路调控改变转而走向坏死或凋亡,当然亦有可能通过影响某些关键细胞通路调控而阻断细胞焦亡的发生,进而保护免疫系统功能正常发挥。因此,寻找这些关键性的细胞通路信号分子显得尤为重要。有报道指出,RAGE敲除小鼠能耐受盲肠结扎穿孔引起的感染性休克,大大改善脓毒症小鼠的生存率,表明RAGE在脓毒症发生发展过程中发挥重要作用。RAGE属于免疫球蛋白超家族,也是促炎因子HMGB1的高结合力受体,可触发多种信号通路,参与了 HMGB1在炎症反应中的作用。HMGB1作为脓毒症“晚期炎性介质”,是促炎细胞因子反应网络的中心环节,是脓毒症发生发展中的重要炎性介质,是近年来脓毒症防治领域研究的热点。给予HMGB1抗体,可明显降低小鼠死亡率。因此HMGB1-RAGE轴在脓毒症发病过程中发挥重要作用,亦是有效防治脓毒症的重要靶点。目前已有研究报道TLRs和RAGE下游信号分子存在广泛的crosstalk,可以放大或汇聚生物信号,并且这种crosstalk要求TLRs和RAGE的活化或抑制在空间和时间上具有一定的同步性。基于我们前期研究发现,HMGB1内化进入细胞后,可通过RAGE依赖性地引起巨噬细胞发生焦亡。但对于HMGB1-RAGE轴在脓毒症所致细胞焦亡种的具体作用机制有待进一步阐明。因此本研究的目的在于探讨肽聚糖PGN引起巨噬细胞焦亡在脓毒症中的作用地位极其具体机制,阐明脓毒症诱导细胞焦亡的具体信号通路,上下游信号分子及某些信号分子间的相互作用,为进一步明确脓毒症的病理生理过程提供理论基础,也为临床从抗炎和改善免疫抑制两方面同时诊治脓毒症提供新的治疗靶点。主要方法和结果:第一部分 PGN-TLR2转录上调RAGE细胞膜蛋白表达(体内+体外)目的从体内、外观察巨噬细胞给予PGN刺激后,检测RAGE表达变化情况主要方法和结果1.体内:WT和TLR2-/-小鼠均腹腔注射PGN(40mg/kg),模拟腹腔感染致脓毒症模型。并收集不同时间点腹腔巨噬细胞(0,6,12,24h)。Western blot方法分析RAGE蛋白表达水平。RT-PCR方法检测不同时间点RAGE基因的转录水平。流式细胞仪观察RAGE蛋白细胞膜表面表达水平。进一步用激光共聚焦显微镜观察RAGE蛋白在细胞上的分布情况。结果显示PGN腹腔注射6h后即可引起腹腔巨噬细胞RAGE蛋白表达有所提高,至12h表达明显升高,24h表达进一步增强。表明PGN腹腔注射6h即可能通过引起机体产生炎症反应而诱导RAGE表达增加。且通过PCR结果判断这种蛋白水平的升高来源于基因转录水平的增加。而在TLR2-/-的小鼠巨噬细胞,给予PGN刺激后,RAGE蛋白表达水平无明显变化。RAGE蛋白的细胞膜分布是其发挥功能作用所必需的。流式细胞术检测结果显示RAGE蛋白的细胞膜分布在6h明显增加,直至24h仍明显高于对照组。激光共聚焦结果再一次从视觉上直接验证了流式结果。但在TLR2-/-巨噬细胞,PGN并未引起RAGE细胞膜蛋白表达增加。2.体外:提取WT和TLR2-/-小鼠原代骨髓巨噬细胞(BMDM),给予PGN刺激(1μg/ml)后不同时间点(0、3、6、9、12、24h)收集样品。Western blot方法分析RAGE蛋白表达水平。RT-PCR方法检测不同时间点RAGE基因的转录水平。流式细胞仪观察RAGE蛋白细胞膜表面表达水平。进一步用激光共聚焦显微镜观察RAGE蛋白在细胞上的分布情况。结果显示PGN刺激3h开始即可引起巨噬细胞RAGE蛋白表达升高,随刺激时间延长而进一步表达增强,至12h出现显著升高,并持续维持至24小时。根据RT-PCR结果我们发现RAGE蛋白水平的升高来源于基因转录水平的增加,在PGN刺激3h时可观察到RAGE mRNA水平增加,12h到高峰。而在而TLR2-/-BMM没有出现RAGE蛋白表达变化。RAGE蛋白的细胞膜分布是其发挥功能作用所必需的。进一步运用流式细胞术检测结果显示RAGE蛋白的细胞膜分布随着PGN刺激时间的延长而增加,直至24h仍明显高于对照组。激光共聚焦结果再一次从视觉上直接验证了流式结果。但在TLR2-/-BMDM,PGN并未引起RAGE细胞膜蛋白表达增加。结论从体内外实验给予PGN刺激,PGN刺激可以从基因转录水平明显上调RAGE蛋白表达,并主要以膜蛋白形式增加;这种转录是TLR2信号依赖型。第二部分 上调的RAGE表达加剧巨噬细胞焦亡形成(体内+体外)目的观察RAGE表达上调以后,对巨噬细胞焦亡的影响及其作用机制。主要方法和结果1.体内:WT和RAGE-/-小鼠均腹腔注射PGN(40mg/kg),模拟腹腔感染致脓毒症模型。并收集不同时间点小鼠腹腔巨噬细胞、肺泡巨噬细胞和血单核/巨噬细胞(0,12,24h)。焦亡细胞的主要生物学特性是伴有caspase-1的激活和TNNEL阳性。Caspase-1未活化时主要以pro-caspase-1形式存在,分子量为45ku,活化后裂解产生P20和P10两个片段。因此提取腹腔巨噬细胞总蛋白,用Western blot方法检测caspase-1蛋白的剪切体P20(分子量20KD)表达水平,观察 caspase-1 激活情况。分别用 FLICA caspase-1 fluorescent reagent(AF488)绿色荧光标记活化的caspase-1,Cell Death reagent(TMR red)红色荧光标记损伤的DNA,双阳表明细胞发生了焦亡。收集腹腔、肺泡和血液中的巨噬细胞进行流式细胞术检测细胞焦亡水平,激光共聚焦显微镜进一步观察焦亡细胞形态。结果显示,PGN腹腔注射可引起小鼠腹腔巨噬细胞caspase-1激活,且刺激时间越长激活越明显;也可以诱导巨噬细胞DNA损伤,表明PGN可以诱导巨噬细胞焦亡的发生。但在RAGE-/-小鼠,我们发现PGN不能激活caspase-1,也不能诱导细胞DNA损伤,说明PGN诱导的巨噬细胞焦亡时RAGE依赖的。2.体外:提取WT和TLR2-/-小鼠原代骨髓巨噬细胞(BMM),首先给予PGN(1μg/ml)刺激12h后,更换为新鲜培养基,再加入HMGB1 1(0.25μg/ml)刺激不同时间点(3、6、12、24h)。各时间点收集样品,Western blot方法检测caspase-1活化水平,流式细胞术和激光共聚焦显微镜观察细胞焦亡发生比例和形态。结果显示,本研究中给予的HMGB1刺激巨噬细胞可以引起轻度caspase-1的激活,但尚不足以引起DNA损伤,诱导巨噬细胞发生焦亡。但在给予PGN预刺激12h诱导RAGE表达增加后,再给予HMGB1刺激,通过调高的RAGE可以放大HMGB1的作用,使caspase-1激活程度增加,并诱导巨噬细胞焦亡产生,并随着刺激时间延长焦亡细胞比例逐渐增加。但在RAGE-/-BMM,PGN+HMGB1刺激并不能诱导出上述现象产生。说明RAGE在诱导巨噬细胞焦亡过程中起着举足轻重的作用。结论 通过PGN-TLR2上调的RAGE表达,可以加速Caspase-1的激活,进而加剧细胞焦亡的形成。第三部分脓毒症引起RAGE表达上调加剧巨噬细胞焦亡发生1.TLR2介导脓毒症诱导RAGE表达上调目的为进一步明确巨噬细胞焦亡在更具生物学意义的脓毒症模型中作用地位及上游信号分子作用,采用盲肠结扎穿孔术(cecum ligation and puncture,CLP)模拟经典脓毒症模型,观察CLP术后RAGE表达情况。主要方法和结果使用WT,TLR2-/-小鼠,采用盲肠结扎穿孔术(cecum ligation and puncture,CLP)诱导的脓毒症模型,分为三个实验组:Sham组,CLP 12h和 CLP 24h组。在不同时间点收集各组小鼠腹腔巨噬细胞,肺泡巨噬细胞及血液中单核/巨噬细胞进行各项检测。Western blot方法检测各组腹腔巨噬细胞RAGE蛋白表达情况,RT-PCR检测腹腔巨噬细胞RAGE mRNA表达水平。流式细胞术检测RAGE蛋白的细胞膜分布情况。结果显示,CLP术后12h即可诱导RAGE蛋白表达增加,至24h升高更明显。RT-PCR结果显示RAGE通过转录水平引起蛋白表达增加。进一步的流式结果分析得出,RAGE蛋白表达的增加主要分布在细胞膜上,因为RAGE细胞膜表面的蛋白分布是其发挥功能所必需的,表明CLP诱导上调的RAGE蛋白是具有功能活性的,可诱导下游信号通路作用。但在TLR2-/-小鼠接受CLP术后,并未引起RAGE表达的显著增加,表明TLR2在CLP诱导的巨噬细胞RAGE表达上调过程中起着重要作用。结论成功构建了高度接近脓毒症患者的病理生理机制和临床过程的CLP模型。发现脓毒症可诱导RAGE转录及蛋白水平增加,并且主要上调具有功能形式的RAGE细胞膜表面蛋白表达,而此过程属于TLR2依赖的。2.上调的RAGE加剧脓毒症诱导的巨噬细胞焦亡形成目的为了探讨RAGE上调的生理学意义,结合前期研究发现RAGE对于引起巨噬细胞焦亡至关重要。我们进而研究上调的RAGE对巨噬细胞焦亡所产生的影响及巨噬细胞焦亡在CLP脓毒症模型中作用地位。主要方法和结果使用WT,TLR2-/-,RAGE-/-,HMGB1-/-,Myd88-/-小鼠,采用盲肠结扎穿孔术(cecum ligation and puncture,CLP)诱导脓毒症模型。并在CLP术后不同时间点(0,12,24h,收集各组小鼠腹腔巨噬细胞、肺泡巨噬细胞及血液在单核/巨噬细胞进行各项检测。Western blot方法检测各组小鼠腹腔巨噬细胞P20表达水平,流式细胞术检测各组小鼠腹腔巨噬细胞、肺泡巨噬细胞及血液中单核/巨噬细胞的焦亡水平,激光共聚焦显微镜从形态上观察焦亡细胞形态。结果显示,CLP可诱导WT小鼠腹腔巨噬细胞caspase-1活化,且p20蛋白表达水平随脓毒症时间延长而逐渐增加。TLR2-/-和HMGB1-/-小鼠进行CLP术后,腹腔巨噬细胞的P20表达亦有所增加,但相比WT小鼠升高程度明显降低。而RAGE-/-小鼠腹腔巨噬细胞中则未发现caspase-1激活。为了分析RAGE下游分子Myd88在其中的作用地位,通过对MydSS-/-小鼠进行CLP术后,发现Myd88可以明显降低caspase-1的激活水平。进一步运用流式细胞术和激光共聚焦显微镜观察发现,CLP可诱导caspase-1激活及DNA损伤,表明CLP可诱导巨噬细胞焦亡。但当阻断TLR2信号后,CLP所诱导的巨噬细胞焦亡数目下降了一半,我们推测主要可能是由于阻断TLR2以后,不能诱导RAGE表达上调,进而削弱了 CLP诱导的巨噬细胞焦亡,也从另一方面证实了上调的RAGE可以加剧CLP诱导的巨噬细胞焦亡。阻断HMGB1信号分子后,细胞焦亡程度亦明显下降,表明HMGB1作为脓毒症时重要的晚期致炎分子,在脓毒症所诱导的巨噬细胞焦亡过程中亦起了重要作用,表明巨噬细胞焦亡和脓毒症晚期炎症反应密切相关。进一步阻断RAGE信号通路以后,则不引起巨噬细胞焦亡发生了。同样发现阻断Myd88后,使CLP诱导的巨噬细胞焦亡数目明显下降。表明Myd88和RAGE在CLP诱导的巨噬细胞焦亡中起着重要作用。通过同时对腹腔、肺泡和血液中的巨噬细胞分析发现,脓毒症时引起的巨噬细胞焦亡是全身反应,而非局限于原发感染灶,这有可能是由于脓毒症本身引起的肺脏等其他脏器损伤而诱导的肺泡巨噬细胞焦亡,或者是由于焦亡细胞入血继而随血液循环到达远端脏器进而诱导目标脏器的细胞焦亡,这也从另一方面也说明细胞焦亡可影响全身多脏器功能,故而在脓毒症发生发展中起着重要作用。结论CLP模拟的脓毒症模型可以从转录水平上调巨噬细胞RAGE细胞膜表面表达,并且上调的RAGE可以加剧脓毒症所诱导的巨噬细胞焦亡形成。RAGE-Myd88在脓毒症所诱导的巨噬细胞焦亡过程中起重要作用。HMGB1作为重要的晚期炎症介质亦明显影响脓毒症所诱导的巨噬细胞焦亡,因此细胞焦亡和炎症密切相关。第四部分NLRP3炎性小体和ASC焦亡小体分别在脓毒症早期和晚期诱导巨噬细胞焦亡形成目的 通过检测NLRP3炎性小体和ASC焦亡小体的形成情况,进一步明确脓毒症诱导的巨噬细胞焦亡发生机制。主要方法和结果1.体外:提取WT和NLRP3-/-小鼠的BMM细胞,给予PGN(1 μg/ml)或/和HMGB1(0.25μg/ml)刺激0,3,6,12h后,于各时间点收集细胞样品进行各项检测。用红色荧光标记ASC蛋白,绿色荧光标记NLRP3,用激光共聚焦显微镜观察,若二者出现共定位(橙色)则表明形成NLRP3炎性小体,若ASC聚焦形成团块,则表明ASC焦亡小体形成。运用免疫共沉淀技术检测NLRP3和ASC蛋白结合情况。运用Western blot方法检测caspase-1激活情况(P20)。并进一步用流式细胞术检测细胞焦亡发生率。研究结果发现,单独给予HMGB1刺激时仅在12h时会出现少量的NLRP3炎性小体形成。但给予PGN预刺激12h后,再给予HMGB1刺激时,我们发现在HMGB1刺激3小时即可引起大量NLRP3炎性小体形成,刺激6h时开始出现ASC焦亡小体,并存NLRP3炎性小体,刺激达到12h时,大量ASC焦亡小体形成,并再无NLRP3炎症小体形成,表明PGN预刺激后,可以放大HMGB1的作用,加剧HMGB1所诱导的早期NLRP3炎性小体的形成及晚期ASC焦亡小体的形成。为了进一步证实是否NLRP3炎性小体和ASC焦亡小体可以通过激活caspase-1诱导巨噬细胞焦亡形成,我们进一步通过Western blot方法检测发现,在给予PGN预刺激12h后,可明显放大HMGB1的作用,在HMGB1刺激3h即可诱导caspase-1明显激活和DNA损伤,12h反应更明显。但运用NLRP3-/-BMM给予相应刺激后,我们发现在早期3h时由于阻断了 NLRP3信号分子,导致NLRP3炎性小体不能形成,继而不能激活caspase-1,诱导细胞焦亡产生。而在晚期12h时,因ASC焦亡小体的大量形成,可以激活caspase-1,继而诱导细胞焦亡,但相比WT组,程度明显下降。2.体内:采用WT和NLRP3-/-小鼠进行CLP造模,模拟脓毒症模型。并在各时间点(0,12,24h)收集腹腔巨噬细胞、肺泡巨噬细胞核血液中单核/巨噬细胞进行各项检测。用激光共聚焦显微镜观察NLRP3炎性小体和ASC焦亡小体的形成情况,Western blot方法检测caspase-1激活情况(P20)。并进一步用流式细胞术检测细胞焦亡发生率。结果显示,在CLP术后12可诱导NLRP3炎性小体形成,24h时可诱导ASC焦亡小体形成。表明脓毒症早期主要以NLRP3炎性小体为主,而晚期主要以ASC焦亡小体形成为主。Western blot方法检测P20显示,敲除NLRP3信号分子后,在CLP早期12h时不激活caspase-1,不诱导巨噬细胞焦亡产生,但在晚期24h时明显诱导caspase-1激活和巨噬细胞焦亡发生,但相对WT而言,程度明显减轻。结论脓毒症诱时巨噬细胞通过早期形成NLRP3炎性小体,晚期形成ASC焦亡小体,引起caspase-1激活,进而诱导细胞焦亡形成。当敲除NLRP3基因时,可阻断早期NLRP3炎性小体的形成,不激活caspase-1和细胞焦亡,但ASC焦亡小体的形成不依赖NLRP3,故而在晚期ASC焦亡小体作为危险信号分子亦可单独激活caspase-1,诱导巨噬细胞焦亡形成。第五部分巨噬细胞焦亡放大机体炎症反应目的为了探明发生焦亡的巨噬细胞会给机体带来何种生物学效应,基于焦亡细胞最终会引起细胞崩解,细胞内容物释放,其中包括很多DAMPs,我们推测这些释放的细胞内容物可能会作用于邻近细胞,进而引起邻近细胞发生炎症反应,从而放大了机体的炎症反应。主要方法和结果提取WT小鼠的BMM细胞,运用PGN和HMGB1诱导焦亡细胞的产生,进而将焦亡巨噬细胞与正常巨噬细胞进行共培养。收集共培养后不同时间点的正常细胞和上清,运用ELISA试剂盒检测IL-6,IL-1β和IFN-γ表达水平。结果显示,共培养后上清中可检测到IL-6,IL-1β和IFN-y释放,且随着共培养时间延长,各炎症因子表达水平增加。对正常细胞内各炎症因子表达水平的检测发现,共培养6h即可引起各炎症因子表达水平升高,至12h明显增加,除IFN-y在24h表达下降以外,其他炎症因子表达仍持续明显升高。结论焦亡细胞可释放多种炎症因子,进而引起邻近正常细胞发生炎症反应,放大机体炎症反应。因此,阻断细胞焦亡的形成对于控制机体的炎症级联反应显得尤为重要。