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光动力治疗(Photodynamic Therapy,PDT)是一种很有发展前景的抗表皮肿瘤的治疗策略,因其微创、低毒、高效和可控等特性,在肿瘤治疗中显示出巨大优势。在光动力治疗的过程中,光敏剂和氧气作用产生的单线态氧(1O2)被广泛地认为是光动力治疗中的关键因子。众所周知,药理活性分子能否与靶标相互作用是药物充分发挥治疗效果的关键因素。药物的亚细胞器分布影响药物的治疗效果,通过药物亚细胞器分布调控可以实现精准性治疗。同样,光敏剂的亚细胞器分布也会影响药物的作用效果。因为,1O2的半衰期短(<40 ns)且扩散距离有限(<20 nm),只能在生成部位发生作用。传统的光敏剂因不具备靶向性使得光动力治疗的疗效降低,甚至造成正常组织的损伤。所以,通过调控光敏剂的亚细胞器分布实现肿瘤精准治疗显得尤为重要。然而,无论是已报道的细胞膜靶向光动力治疗,还是线粒体靶向光动力治疗,这些单一的亚细胞器靶向策略都没有发挥最大的治疗效应。显然,将细胞膜靶向光动力治疗和线粒体靶向光动力治疗相结合可能是一种更有效的肿瘤治疗策略,而这种简单的双靶向组合策略很少被报道。研究目的本研究拟制备一种线粒体和细胞膜双重靶向自传递嵌合肽(PpIX-KrFxrFxrFxr-PEG8,M-ChiP),用于肿瘤协同光动力治疗的研究。从体外实验及动物实验探讨该嵌合肽细胞膜和线粒体的双重亚细胞器靶向功能能否实现肿瘤协同光动力治疗,从而实现肿瘤精准治疗的作用。研究方法1.通过检测M-ChiP的粒径、电镜和紫外对其进行结构表征。2.通过单线态氧绿色荧光探针(SOSG)测定M-ChiP的1O2产生能力,并以荧光染料DCFH-DA为检测指示剂检测ROS的产生。3.用细胞膜绿色荧光探针(Dio)、溶酶体绿色荧光染料(Lyso Tracker Green)、线粒体绿色荧光染料(Mito Tracker Green)和细胞核染料(Hoechst 33342)研究M-ChiP在4T1细胞中的亚细胞器分布特征。以台盼蓝为检测指示剂用倒置显微镜观察细胞膜的完整性,以罗丹明123为检测指示剂用激光扫描共聚焦显微镜观察线粒体的膜电位,并用流式细胞仪定量分析。以此评估在激光照射条件下由M-ChiP的光动力治疗诱导的亚细胞破坏能力。4.采用MTT法、流式细胞术以及活死细胞双染实验对双靶向M-ChiP的体外抗肿瘤作用进行了研究。5.构建小鼠乳腺癌动物模型,研究M-ChiP的体内分布和体内抗瘤活性。研究结果1.动态光散射结果显示该纳米颗粒的流体动力学尺寸约为167.9 nm。电镜结果显示该纳米颗粒均匀分散。紫外光谱显示M-ChiP在400 nm处的有一尖峰且在530 nm、580 nm和630 nm处有特征特征吸收峰。2.SOSG检测单线态氧1O2的产生情况,接受光照的M-ChiP+light组SOSG的荧光强度显著性增强。同样地,以DCFH-DA作为ROS传感器检测细胞内ROS的产生,发现了类似的结果。3.Di O,MitoTracker Green的绿色荧光与M-Chip的红色荧光可以很好地重合且大多数LysoTracker Green的绿色荧光和M-ChiP的红色荧光存在一定程度上的重合,而M-ChiP的红色荧光与Hoechst33342的蓝色荧光几乎没有重叠。4.空白组细胞和未被激光照射的M-ChiP组细胞不被台盼蓝染色,而接受光照的M-ChiP+Light组的细胞变蓝。在没有激光照射的条件下,M-ChiP处理的4T1细胞呈现出明显的绿色荧光,而接受激光照射的M-ChiP组,该组中的4T1细胞几乎没有发现荧光。5.MTT结果显示M-ChiP对4T1细胞存在浓度依赖的光毒性且表现出明显较低的暗毒性。流式细胞术检测结果显示激光照射30 s后,有一半以上的4T1细胞处于早期凋亡或晚期凋亡状态。活/死细胞检测结果显示在激光照射30 s后,M-ChiP孵育的4T1细胞出现了明显的PI红色荧光。6.在12小时M-ChiP的红色荧光在肿瘤部位的积累到达最高,此后因为代谢的原因,肿瘤部位的荧光逐渐降低。接受激光照射的M-ChiP+Light组小鼠的肿瘤明显受到抑制,表现出良好的抗肿瘤作用。血常规检查未发现异常且生化试验结果无明显差异。H&E染色结果显示接受M-ChiP光动力治疗后的小鼠的主要脏器未见明显生理形态变化。研究结论1.透射电镜观测和动态光散射结果证明我们成功制备了均匀分散的纳米颗粒,紫外光谱结果说明M-ChiP具有光敏剂原卟啉的紫外吸收性质。2.相较于游离的光敏剂PpIX,M-ChiP在激光照射下能够产生更多的1O2。以DCFH-DA作为ROS传感器检测细胞内ROS的产生,发现了类似的结果,说明M-ChiP在肿瘤光动力治疗中的巨大潜力。3.M-ChiP具有细胞膜和线粒体的靶向能力。4.在激光照射条件下锚定在细胞膜和线粒体上的M-Chi P产生的ROS会破坏细胞膜与线粒体的完整性。5.M-ChiP通过细胞膜和线粒体的双重靶向定位效果显著性加重了光损伤程度,获得高效的体外协同抗肿瘤效果。6.M-ChiP可以通过EPR效应在肿瘤组织中的富集,通过光动力学治疗能有效实现肿瘤生长抑制。同时,M-ChiP还具有良好的生物相容性和生物安全性。