产肠毒素大肠杆菌(ETEC)是革兰氏阴性肠道病原体,是引起人类和动物腹泻的重要原因之一。长期以来抗生素治疗ETEC引起的腹泻越来越难以达到治愈目的,严重的耐药性和国家对抗生素添加饲料的严格限制,迫切需要无抗、安全、绿色的生物制剂防制ETEC引起的腹泻,减少因腹泻带来的巨大经济损失。本研究拟构建K99蛋白的重组干酪乳杆菌表达系统,获得K99候选的微生态制剂,口服免疫后研究重组干酪乳杆菌的免疫原性及其与特异性sIgA形成的抗原-抗体复合物是否能够有效的阻止病原体进入肠上皮细胞,从而维持肠上皮细胞的完整性,进而为预防ETEC相关腹泻性疾病提供理论依据。本研究利用基因工程手段,PCR获得ETEC K99基因,克隆到pQE-30载体上,获得了重组子pQE-K99/E.coli,表达纯化后的重组蛋白免疫新西兰大白兔四次,获得anti-K99血清,为后续免疫学实验提供多克隆抗体。以eGFP基因作为报告基因,构建eGFP标记K99的基因工程大肠杆菌和乳酸菌,利用免疫印迹、荧光显微镜技术和流式细胞术检测K99融合蛋白的表达,采用激光共聚焦技术检测融合蛋白展示在了干酪乳杆菌表面。将重组干酪乳杆菌连续7天口服免疫SPF Balb/c小鼠,检测血清的特异性IgG和粪便、肠冲洗液的特异性sIgA水平,在免疫后4d,6d,8d和10d对小鼠进行ETEC K99攻毒实验,攻毒后1d采集小鼠肠道组织制备冰冻切片,免疫组化染色,在荧光显微镜下观察结合基因工程乳酸菌形成的sIgA-抗原复合物是否能够有效的阻止ETEC K99进入肠上皮细胞。构建的重组子pQE-K99/E.coli,经IPTG诱导表达,获得的目的蛋白通过纯化,获得了2.08 mg/mL的K99表达蛋白,以2 mg/只重组蛋白免疫新西兰大白兔,获得了效价高达1:51200的多克隆抗体。构建eGFP标记K99的基因工程质粒pLA-K99-eGFP,经鉴定正确后,电转至干酪乳杆菌,获得了表达融合蛋白的重组干酪乳杆菌表达系统,且重组蛋白展示表达在菌体表面。Western Blot检测到大小为86 kDa的融合蛋白,表明外源蛋白能够与兔源K99抗血清结合,具有良好的反应原性。将重组菌pLA-K99-eGFP/L.casei以灌胃方式口服给SPF Balb/c小鼠,在免疫后1-12d采集小鼠血液、粪便和小肠洗液,检测到了高于对照3倍以上的特异性IgG和sIgA抗体水平。小鼠PP结及肠道组织的冰冻切片免疫组化结果表明,pLA-K99-eGFP/L.casei在免疫小鼠后,重组菌可以定植在小鼠肠道,并与sIgA形成了抗原-抗体复合物,与sIgA共同发挥免疫清除功能,攻毒后,发现在免疫重组菌的小鼠肠道中,ETEC K99未能侵入小鼠小肠上皮细胞,而对照PBS组和对照LAB组,则能发现明显的ETEC K99侵入小鼠小肠上皮细胞。因此,pLA-K99-eGFP/L.casei能够刺激机体产生大量的sIgA,有效的阻止病原体进入肠上皮细胞,从而维持肠上皮细胞的完整性。