【摘 要】
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目的:1.分析LETM1在肝癌组织中的表达情况,探讨LETM1表达水平与临床病理参数及预后的关系;2.观察干扰LETM1对肝癌细胞增殖、凋亡和自噬表型的影响;3.探讨LETM1通过AMPK调控肝癌细胞凋亡与自噬的分子机制。方法:1.通过Oncomine数据库分析LETM1在肝癌组织及正常肝组织中的表达情况及其与预后的关系;采用q RT-PCR、WB进一步验证LETM1在临床标本的表达情况;免疫组织
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目的:1.分析LETM1在肝癌组织中的表达情况,探讨LETM1表达水平与临床病理参数及预后的关系;2.观察干扰LETM1对肝癌细胞增殖、凋亡和自噬表型的影响;3.探讨LETM1通过AMPK调控肝癌细胞凋亡与自噬的分子机制。方法:1.通过Oncomine数据库分析LETM1在肝癌组织及正常肝组织中的表达情况及其与预后的关系;采用q RT-PCR、WB进一步验证LETM1在临床标本的表达情况;免疫组织化学检测LETM1在配对肝癌组织及癌旁组织的表达情况,并根据免疫组化结果分析LETM1表达水平与肝癌患者临床病例资料及总体生存率的关系。2.运用RNAi技术及慢病毒转染技术构建LETM1敲低的Huh7及QGY-7701稳转株;采用CCK8检测细胞存活率,PI染色检测细胞周期;利用Annexin V-FITC/PI双染色法、AO/EB双重荧光染色法检测细胞凋亡;运用免疫荧光检测自噬标记蛋白LC3的表达水平,透射电子显微镜观察细胞自噬小体;运用Western blot检测凋亡相关蛋白（p-Bcl-2、Bcl-2、Bax、caspase-3）以及自噬相关蛋白（Beclin-1、p62、LC3）的表达水平。3.使用AMPK抑制剂,运用Western blot方法检测AMPK与p-AMPK、凋亡相关蛋白（p-BCL-2、BCL-2、Bax和Caspase-3）和自噬相关蛋白（Beclin-1、p62及LC3）在各组中的表达情况;Co-IP实验技术检测Beclin-1与Bcl-2之间的相互结合情况。结果:1.Oncomine数据库分析结果显示:相较于正常肝组织,LETM1在肝癌组织中的表达增高,且LETM1高表达组患者总体生存期劣于低表达LETM1组患者;（2）q RT-PCR、Western blot及免疫组织化学检测结果显示:LETM1在肝癌组织中表达高于癌旁组织,且LETM1表达水平与肿瘤大小、门静脉癌栓和转移及TNM分期密切相关。（3）Kaplan-Meier分析结果显示:与低表达LETM1患者相较,LETM1高表达的HCC患者预后更差。2.使用RNAi技术及慢病毒转染技术成功构建LETM1敲低的Huh7和QGY-7701肝癌细胞稳转株。（2）CCK-8检测结果显示:sh-LETM1组细胞的增殖活性较sh-NC组均明显降低;流式细胞术检测细胞周期结果显示:与sh-NC组比较,sh-LETM1组细胞处于G0/G1期细胞比例均增多,而S期和G2/M期则均降低。（3）Annexin V/PI双标与AO/EB双重荧光染色法检测细胞凋亡结果显示:与sh-NC组相比,sh-LETM1组的细胞凋亡均明显增高。（4）免疫荧光检测不同组别中细胞自噬标记蛋白LC3的表达水平变化。结果显示:sh-LETM1组细胞内LC3的荧光强度均明显高于sh-NC组;透射电镜观察自噬小体,结果显示:sh-LETM1组细胞内的自噬体数量高于sh-NC组。（5）Western blot检测结果显示:sh-NC组相比,sh-LETM1组细胞中p-Bcl-2/Bcl-2比值、Bax、Caspase-3、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白水平均明显增加,而p62水平均明显下降。3.Western blot结果显示:（1）与sh-NC组相比,sh-LETM1组细胞中p-AMPK的表达水平均增高,而AMPK的表达水平均类似;（2）与sh-NC相较,sh-LETM1组的p-Bcl-2/Bcl-2比值、Bax、Caspase-3、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平均增高,p62表达的降低,但与sh-LETM1组相较,Dorsomorphin+sh-LETM1组中的p-Bcl-2/Bcl-2比值、Bax、Caspase-3、Beclin-1、LC3Ⅱ/Ⅰ的表达水平均降低,p62表达的增高。Co-IP实验结果显示:与sh-NC组相较,sh-LETM1组BCL-2沉淀物中Beclin-1蛋白的含量降低,而BCL-2表达未发生变化;同样免疫沉淀Beclin-1,然后检测Bcl-2,结果提示:sh-LETM1组Beclin-1沉淀物中BCL-2蛋白的含量降低,Beclin-1蛋白含量升高。此外,抑制AMPK可逆转LETM1-sh RNA对Beclin-1/Bcl-2复合体解离的影响。结论:1.LETM1在肝癌组织中表达高于癌旁组织,且LETM1表达水平与肿瘤大小、门静脉癌栓和转移及TNM分期相关。高表达LETM1组患者较低表达LETM1组患者的总体生存期短;2.LETM1敲低可以抑制肝癌细胞的增殖,促进肝癌细胞凋亡和自噬;3.LETM1敲低可以通过磷酸化AMPK调控肝癌细胞的自噬和凋亡;4.LETM1敲低活化AMPK调节肝癌细胞的凋亡和自噬,可能是通过Beclin-1/Bcl-2复合物的解离和Bcl-2磷酸化途径实现的。
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