【摘 要】
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本研究利用PCR-RFLP方法鉴定并证明苏云金杆菌Bt4菌株含有cry9基因,以Bt4的质粒为模板,利用全长引物F9EA /R9EA进行PCR扩增,得到全长cry9E基因。将目的片段插入到表达载体pET21b,得到大肠杆菌重组表达质粒pETcry9Ea。经测序和Blastn比对分析,证明克隆的基因为cry9Ea基因,提交GenBank登记,登录号为FJ380927。该基因读码框为3453个碱基,编
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本研究利用PCR-RFLP方法鉴定并证明苏云金杆菌Bt4菌株含有cry9基因,以Bt4的质粒为模板,利用全长引物F9EA /R9EA进行PCR扩增,得到全长cry9E基因。将目的片段插入到表达载体pET21b,得到大肠杆菌重组表达质粒pETcry9Ea。经测序和Blastn比对分析,证明克隆的基因为cry9Ea基因,提交GenBank登记,登录号为FJ380927。该基因读码框为3453个碱基,编码1150个氨基酸,所推导的蛋白质的分子量为130 kDa,经国际Btδ-内毒素命名委员会正式命名为cry9Ea7。该基因与其它cry9Ea基因序列相似性为98%～99%,该序列推断的氨基酸序列与其它Cry9Ea类蛋白氨基酸残基相似性为97%～98%。将重组表达质粒pETcry9Ea转化E.coli BL21（DE3）,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测,证实cry9Ea7基因在E.coli BL21（DE3）表达130 kDa的蛋白,再将cry9Ea7基因连接到穿梭载体pSXY422b,电激转化HD73-（cry-）,构建工程菌BioHD9Ea7,通过SDS-PAGE和Western blot分析,表明cry9Ea基因也能在HD73-（cry-）中稳定表达。比较BioHD9Ea7、HD73-（pSXY422b）与对照菌株HD73-的生长情况,发现工程菌导入的cry9Ea7基因对受体菌HD73-的生长速率没有显著的影响。提取Cry9Ea7晶体蛋白,经BCA方法定量,然后进行生物活性测定。生物活性测定结果显示Cry9Ea7蛋白对粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）初孵幼虫具有高毒力,LC50为0.044μg/mL,而对甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）和棉铃虫（Helicoverpa armigera）初孵幼虫未显示活性。
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