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目的1通过将携带有B区缺失的凝血因子FVIII(B-domain-deleted human coagulant factor VIII,BDDh FVIII)的重组腺病毒载体(Ad-BDDh FVIII-GFP)及携带人凝血因子IX(human Coagulation Factor IX,h FIX)的重组腺病毒载体(AdFIX-GFP)转染的脂肪干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC)进行传代培养,观察h FVIII、h FIX的表达情况,探讨BDDh FVIII及h FIX是否可以在ADSC内稳定表达;2通过将BDDh FVIII经过直接途径(in-vivo)和间接途径(ex-vivo)注射入血友病A(hemophilia A,HA)鼠体内,观察h FVIII在体内表达情况,探讨ADSC是否可以作为HA基因治疗的靶细胞载体。方法1 BDDh FVIII在ADSC内的稳定表达:实验分为4组,P0组:正常ADSC;P1组:Ad-BDDh FVIII-GFP首次转染ADSC;P2组:Ad-BDDh FVIII-GFP转染ADSC细胞传代后1代;P3组:Ad-BDDh FVIII-GFP转染ADSC细胞传代后2代。2 BDDh FVIII在体内表达情况:将Ad-GFP转染的ADSC(A组)、AdBDDh FVIII-GFP转染的ADSC(B组)、Ad-BDDh FVIII-GFP(C组)及Ad-GFP(D组),经尾静脉注射入HA鼠体内,在注射前1周、注射后第1、7、14、21、28天采集血液标本,注射后第28天采集肝脏组织标本。3 h FIX在ADSC内稳定表达:实验分为4组,A组:Ad-FIX-GFP首次转染ADSC;B组:Ad-FIXGFP转染ADSC细胞传代后1代;C组:Ad-FIX-GFP转染ADSC细胞传代后2代;D组:正常ADSC。通过逆转录聚合酶链反应(Reverse transcriptionpolymerase chain reaction,RT-PCR)检测ADSC内及肝脏内基因转录,酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测ADSC上清液及血浆中凝血因子抗原及免疫印迹试验(Western blot,WB)检测ADSC内及肝脏内携带凝血因子蛋白。结果1 BDDh FVIII在ADSC内的稳定表达:与P0组相比,P1组、P2组及P3组均可见到BDDh FVIII基因表达条带。h FVIII:Ag检测结果P1组(140.260±2.290ng/m L)、P2组(118.140±21.050ng/m L)、P3组(107.730±4.530ng/m L)水平高于P0组(80.02±0.21 ng/m L),差异具有显著性(P<0.05)。h FVIII蛋白表达灰度值与P0组比较,P1组(0.630±0.070)、P2组(0.450±0.040)、P3组(0.250±0.020)明显升高,差异具有显著性(P<0.05)。2BDDh FVIII在体内表达:B组及C组血浆中均可见到h FVIII:Ag的升高,肝脏组织中BDDh FVIII基因转录及h FVIII蛋白结果显示,B组及C组结果为阳性。与A组及D组比较,差异具有显著性(P<0.05)。3 h FIX在ADSC内稳定表达:与D组相比,A、B、C组可检测到h FIX基因转录。h FIX:Ag结果显示A组(81.620±8.820ng/m L)、B组(52.496±3.246ng/m L)、C组(47.407±4.002ng/m L)明显高于D组(0.751±0.426ng/m L),差异具有显著性(P<0.05)。h FIX蛋白表达灰度值与D组相比,A组(0.680±0.100)、B组(0.490±0.150)、C组(0.180±0.050)明显升高,差异具有显著性(P<0.05)。结论1 BDDh FVIII可以在ADSC内稳定表达,并可在HA鼠体内分泌凝血因子VIII,腺病毒介导的血友病A基因治疗在动物体内可以成功表达。2 Ad-h FIX-GFP转染后的ADSC可以稳定表达h FIX。3 ADSC可以作为血友病基因治疗的靶细胞载体。图13幅;表13个;参135篇。