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[目 的]通过构建miR-491过表达的腺病毒载体,并将其转染进肝癌高转移潜能细胞系HCCLM6,传代培养HCCLM6细胞,检测miR-491在肿瘤细胞中的表达,观察肝癌细胞的增殖、粘附及侵袭能力变化,利用western blot及免疫荧光测量E-cadherin,N-cadherin,Vimentin,MMP2,GIT1,ERK 的水平变化,评估 miR-491的表达差异对肝癌细胞增殖、粘附及侵袭能力的影响和EMT相关蛋白水平及其通路相关关键分子的影响,进而研究过表达miR-491通过EMT抑制肝癌侵袭转移的影响。[方法](一)构建miR-491过表达的腺病毒载体:设计及合成ADV2-shRNADNA模板、以及模板的退火,构建载体,并对其测序得到正确的序列,进而使用腺病毒包装。(二)HCCLM6细胞持续扩增培养及冻存(三)HCCLM6细胞转染:细胞传代扩增、细胞铺板,按不同的MOI值根据病毒滴度计算出相应的病毒溶液量与含有终浓度为5ug/ml的polybrene的培养基混合均匀;换液,48h后拍照观察各个组细胞生存状况,并检测各个组中mir-491表达量。(四):HCCLM6细胞的培养观察与传代:将冻存的HCCLM6细胞,快速解冻,加入培养基中,离心后弃去上清液,然后细胞转移到培养瓶中去,在培养箱中培养,同时使用显微镜观察处理组细胞的生长状况。(五):细胞增殖、粘附以及侵袭能力的检测:使用CCK8法,粘附实验及Transwell小室法检测各组细胞的增殖、粘附及侵袭能力。(六):qRT-PCR检测:实时定量逆转录PCR(qRT-PCR)检测GIT1和ERK在各个处理组组中表达水平情况。(七)Western-blot检测:收集细胞样本,选定过表达组、空载体组和空白对照组,将细胞中的总蛋白进行提取,然后通过电泳分离、转模、显影及对灰度值进行计算等步骤之后,检测EMT相关蛋白及通道蛋白的水平变化,并比较各组差异。(八)免疫荧光检测:通过免疫荧光染色等技术,在细胞样本中对EMT相关蛋白及侵袭相关分子进行检测。[结 果](一)通过成功的构建miR-491过表达载体并将其转染到肝癌细胞系HCCLM6,qRT-PCR方法检测各组之间的miR-491表达变化,发现各组之间具有明显差异,转染组(过表达组)较空载体组及空白对照组表达量显著升高,且差异有统计学意义。(二)通过对HCCLM6肝癌细胞的传代培养,收集了大量的肝癌细胞,并观察到过表达组细胞的细胞形态由上皮形态转化为纺锤状的间充质形态过程明显减弱。(三)通过CCK8法,粘附实验及Transwell小室法测量各组细胞的增殖、粘附及侵袭能力,发现有明显差异,且差异有统计学意义,过表达组与空白对照组及空载体组相比,其增殖、及侵袭能力显著降低,粘附能力增强。(四)qRT-PCR方法检测提GIT1及ERK各组之间的表达变化具有明显差异,过表达组GIT1及ERK表达量明显降低。且差异有统计学意义,(五)经Western-blot检测,上皮标志蛋白E-cadherin在过表达组较空白对照组及空载体组升高,而间质标志蛋白N-cadherin和Vimentin蛋白水平较空白对照组及空载体组下降,侵袭标志蛋白MMP2较空白对照组及空载体组降低,通道蛋白GIT1及ERK较空白对照组及空载体组减少,且差异具有统计学意义。(六)经免疫荧光提示各蛋白各组表达具有差异,过表达组间质蛋白Vimentin及N-cadherin表达明显减少,侵袭分子MMP2显著降低。[结 论](一)miR-491高表达有效的抑制HCCLM6肝癌细胞的增殖及侵袭能力,增强粘附性。(二)miR-491高表达抑制肝癌侵袭转移的相关机制与EMT过程的关键蛋白E-cadherin,N-cadherin,Vimentin 有关(三)miR-491可能通过GIT1/ERK调控EMT进程以及影响MMP2抑制肝癌侵袭。