斑马鱼bmal1b的生物钟功能及其在生殖系统作用研究

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生物钟是生物机体内存在得一种内源性调控机制,它几乎控制着机体的一切生命活动。它在分子水平表现为钟基因和钟控基因的振荡型表达,在多种生物中都有报道生物钟基因的存在。目前,生物钟转录-翻译-负反馈调节机制在很多物种中被证实存在。在生物钟调节环路中,Bmal和Clock作为正性组分,编码的蛋白质BMAL和CLOCK可以异二聚化并结合基因的启动子区域E-box(CACGTG)序列,从而驱动下游基因的表达。Per和Cry作为负性组分,可以被BMAL-CLOCK复合体驱动表达,它们编码的蛋白PER和CRY可以结合BMAL-CLOCK复合体并抑制其转录激活作用,从而关闭自身及相关基因的表达。小鼠中有两个Bmal,基因靶向研究表明在维持基因表达的节律和行为活力节律中,Bmal1比Bmal2更为重要。斑马鱼有三个bmal,为bmal1a、bmal1b、bmal2。它们在生物钟环路中的作用仍未能被详尽地研究。  本研究拟筛选ENU诱变的突变体获得bmal1b基因纯合突变体,通过检测突变体的钟基因mRNA表达水平以及行为学检测来分析bmal1b基因突变对斑马鱼造成的影响,从而确定它的功能。并且利用TALENs敲除bmal2基因并获得纯和突变体,为实验室进一步研究bmal2奠定基础。  研究结果:通过PCR扩增和测序,成功建立了斑马鱼bmal1b基因的纯和突变体;通过TALENs技术,成功建立了bmal2基因的突变体并筛选建立了三种纯和突变体。通过荧光定量PCR检测了bmal1b突变体主要钟控基因的表达水平,发现per1a、per1b、cry1ab等基因的表达量明显下调。行为学检测发现,在正常光暗条件下和恒暗条件下,bmal1b突变体的活动量高于野生型,与clock1a基因敲降的结果相一致,表明斑马鱼bmal1b基因在核心生物钟环路中具有重要作用。同时发现bmal1b突变体的产卵能力同野生型相比较弱,激素含量检测发现了突变体的雌二醇含量明显低于野生型。生殖相关基因定量检测发现雌二醇合成决定基因cyp19a1a在bmal1b突变体中表达显著性下调,表明bmal1b基因对生殖相关基因具有调控作用。bmal1b突变最终导致雌鱼雌二醇含量减少,影响其生殖能力。因此,斑马鱼bmal1b在生物钟功能和生殖系统中都具有重要作用。
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