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目的:尽管目前有文献报道CLIC4(Chloride intracellular channel 4)与多种癌症有关,但其在胃癌中的作用仍不清楚。目前的研究重点是探究CLIC4在胃癌肿瘤生长和发展中的具体作用。方法:在一组(4对)胃腺癌样本(Ⅲ-Ⅳ期,HER-2阴性)上应用了同位素相对标记与绝对定量技术(ITRAQ)进行串联质谱分析,并确定CLIC4为胃癌(GC)中具有差异性表达的标志物。然后通过Western blot分析102对胃癌样本及其邻近正常胃组织中CLIC4的表达来验证之前的发现。为了探究CLIC4在肿瘤发展中的作用,本课题检测了3种不同的胃癌细胞系MKN45、N87和AGS中CLIC4的表达水平。通过将CLIC4过表达和敲低的慢病毒转染胃癌细胞(MKN45,N87,AGS),然后用嘌呤霉素筛选得到稳转株,接下来通过Transwell和Wound healing实验对CLIC4过表达或敲低的胃癌细胞进行了迁移和侵袭的探究。肿瘤具备对化疗的抵抗性主要是由于肿瘤干细胞的存在。MKN45,N87和AGS细胞含有不同数量的表达CD44和OCT4的肿瘤干细胞。为了探究CLIC4对肿瘤干细胞的作用,本课题通过RT-PCR检测在胃癌细胞中过表达或敲低CLIC4后对CD44和OCT4表达量的影响。随后探究了CLIC4过表达或者敲低后对抗癌药5-Fluorouracil(5-Fu)和Etoposide(VP-16)耐受性的影响。肿瘤干细胞的特征之一是可以在软琼脂中生长并且形成集落,接下来通过软琼脂集落生成实验验证了 CLIC4在胃癌细胞的锚定非依赖性生长的作用。EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition)是产生肿瘤干细胞的机制之一。我们试图探究CLIC4是否会影响EMT。于是通过Western blot和免疫荧光实验探究敲低或过表达CLIC4后在EMT中的作用。同时还验证了过表达或敲低CLIC4后对EMT 标记物的影响,比如 Snai1,Snai2,Snai3,Zeb1,Zeb2 等。为了探究CLIC4在体内对肿瘤生长的作用,我们通过将过表达CLIC4的MKN45细胞或者敲低CLIC4的N87细胞注射到雄性裸鼠背部皮下来构建异种肿瘤移植模型,以此观察CLIC4对肿瘤生长的影响。结果:1、通过ITRAQ技术分析将CLIC4作为胃癌的一个新标记物。与邻近正常组织相比,胃癌组织中CLIC4的表达降低,并且CLIC4的表达水平与胃癌临床分期呈负相关。2、RT-PCR和Western blot实验分析显示,CLIC4的表达水平与MKN45、N87和AGS细胞的致瘤性呈负相关,表明CLIC4可能是肿瘤抑制因子。在N87细胞中敲低CLIC4后促进了胃癌细胞的迁移和侵袭,在MKN45细胞中过表达CLIC4后则抑制了胃癌细胞的迁移和侵袭。使用N87和AGS细胞进行Wound healing实验的结果进一步表明,CLIC4对肿瘤细胞的迁移有抑制作用。3、结果表明,与N87和AGS细胞相比,侵袭性更强的MKN45细胞高表达CD44和OCT4。CLIC4过表达后抑制了 CD44和OCT4的表达,CLIC4敲低后增强了 CD44和OCT4的表达,表明CLIC4对肿瘤细胞的干性有抑制作用。MKN45细胞形成的集落比N87和AGS细胞更多、更大。在MKN45细胞中过表达CLIC4时,与对照相比,形成的集落数量和大小显著减少。相比之下,在N87细胞中敲低CLIC4后,与对照相比,集落的形成能力增强,表明CLIC4敲低后促进胃癌细胞锚定非依赖性生长。与CD44和OCT4的表达水平一致,MKN45细胞对5-Fluorouracil(5-Fu)和Etoposide(VP-16)治疗的耐受性更强。此外,用CLIC4过表达的慢病毒转染的MKN45细胞对5-Fu的治疗更敏感,而用CLIC4 shRNA的慢病毒转染的N87细胞对5-Fu的抵抗性更强。4、Western blot和免疫荧光实验显示,当CLIC4过表达后,E-cadherin(E-钙黏蛋白)的表达量上调,Vimentin(波形蛋白)的表达量下调,这意味着CLIC4过表达后抑制了 EMT。相反,在N87细胞中敲低CLIC4后促进了 EMT。在AGS细胞中敲低CLIC4导致Snai3的上调。5、CLIC4过表达后抑制裸鼠肿瘤的生长,CLIC4敲低后促进裸鼠肿瘤的生长。结论:通过ITRAQ确定CLIC4是胃癌中差异表达的标记物。数据分析显示,CLIC4的表达水平与胃癌的临床分期和肿瘤干细胞标志物CD44和OCT4的表达水平呈负相关。敲低CLIC4通过上调转录因子Snai3来促进胃癌细胞的迁移、侵袭和EMT。当CLIC4过表达后,胃癌细胞的锚定非依赖性生长能力减弱,对5-Fu和Etoposide治疗更敏感。当CLIC4在N87细胞中敲低后,裸鼠体内形成肿瘤的能力增强。综上所述,我们首次证明CLIC4通过抑制肿瘤的干性和EMT来抑制胃癌肿瘤的生长。这些发现为胃癌的发病机制提供了新的见解,并可能促进新的靶向治疗的发展。