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背景与目的：近年来肿瘤能量代谢方式的改变被列肿瘤的十大特征之一,肿瘤细胞代谢的研究已经成为当今肿瘤研究的热点。正常细胞在有氧条件下通过氧化磷酸化途径从葡萄糖中摄取能量；在乏氧条件下葡萄糖经无氧糖酵解生成乳酸。肿瘤细胞则与之不同,其在上述两种条件下均表现为葡萄糖的高摄取和糖酵解的活跃,我们称这种现象为Warburg效应(有氧糖酵解)。作为糖酵解限速酶之一的丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK)在其中发挥了重要作用。PKM1和PKM2是PK的两个最重要的同工酶,PKM1主要促进氧化磷酸化,PKM2则主要贡献于有氧糖酵解。PKM1与PKM2是PKM基因转录本的可变剪切产物,前者含专有的外显子9,后者则是外显子10。核内不均一核糖核蛋白(HnRNP)家族(HnRNPA1, HnRNPA2以及HnRNPI)可以促进外显子9的剪切以利于PKM2的剪切生成。癌基因c-Myc则起到了促进HnRNP家族转录的作用。微小RNA(microRNAs, miRNA)是一类高度保守性的非编码小RNA。它们的大小约为19～25个核苷酸。miRNA与其靶信使RNA (messenger RNA, mRNA)的3’UTR区靶位序列完全或不完全配对后,可抑制其转录。miRNA在肿瘤细胞的发生发展过程中扮演了重要作用,近年来有人报道了其在肿瘤细胞能量代谢中亦发挥了重要的作用。let-7a作为一个具有肿瘤抑制作用的miRNA,已经在多种肿瘤组织中被证实,且在许多恶性肿瘤中let-7a可以抑制癌基因c-Myc的表达。此外,HnRNPAl对let-7a还有反馈抑制作用。在本研究中,我们第一次研讨了let-7a在胶质瘤细胞糖代谢中的作用,证实了let-7a/c-Myc/HnRNPAl三者之间存在反馈环路调控PKM2,而影响了胶质瘤细胞的糖代谢水平和生长能力。这些研究为let-7a作为胶质瘤诊断和治疗靶点提供了理论依据。研究方法：1 U87和U251细胞中转染si-PKM2,通过CCK8实验、流式细胞术、葡萄糖和乳酸检测试剂盒、OCR及ECAR测定试验研究PKM2对胶质瘤细胞增殖、周期、糖代谢能力的影响。2 U87和U251细胞中转染let-7a mimics,通过CCK8实验、葡萄糖和乳酸检测试剂盒、OCR及ECAR测定试验研究let-7a对胶质瘤细胞增殖和糖代谢能力的影响。并通过Western blot实验检测上调let-7a后,胶质瘤中细胞中PKM2蛋白表达变化。3 U87和U251细胞中转染si-HnRNPAl,通过w estern blot实验检测PKM1和PKM2的蛋白表达变化,通过实时荧光定量PCR检测外显子9和外显子10的表达变化。葡萄糖和乳酸检测试剂盒、OCR及ECAR测定试验研究HnRNPAl对胶质瘤细胞糖代谢能力的影响。4 利用荧光素酶报告基因实验和western blot实验研究c-Myc与HnRNPAl的靶向调控关系。U87和U251细胞中转染sh-Myc或共转染sh-Myc与HnRNPAl质粒,通过western blot实验、葡萄糖和乳酸检测试剂盒、OCR及ECAR测定实验等研究HnRNPAl是否为c-Myc影响PKM2的表达和胶质瘤糖代谢水平的功能性靶点。5 利用荧光素酶报告基因实验和western blot实验研究let-7a与c-Myc的之间是否存在靶向调控关系。U87和U251细胞中转染let-7a或共转染let-7a与c-Myc质粒,通过western blot实验、葡萄糖和乳酸检测试剂盒、OCR及ECAR测定实验等回复实验研究c-Myc是否为let-7a影响PKM2的表达和胶质瘤糖代谢水平的功能性靶位。6 U87和U251细胞中转染si-HnRNPA1或者HnRNPA1质粒,应用荧光定量PCR分别检测成熟let-7a、pri-let-7a、up.pri-let-7a的变化。7 采用免疫组织化学检测在裸鼠皮下成瘤组织中let-7a对c-Myc、HnRNPA1、PKM2蛋白表达的影响。研究结果：1 在胶质瘤细胞中下调PKM2后,胶质瘤细胞增殖能力受抑制,细胞周期阻滞在G1期。培养基中葡萄糖剩余量升高、乳酸生成量降低,EACR降低,OCR升高。2 在U87和U251细胞中上调let-7a后可以抑制胶质瘤细胞增殖,培养基中葡萄糖剩余量升高、乳酸生成量降低,EACR降低,OCR升高,PKM2的表达下降。3 在U87和U251细胞中下调HnRNPAl后,PKM2表达下降,PKM1表达上升。外显子9表达上升,外显子10表达下降。培养基中葡萄糖剩余量升高、乳酸生成量降低,EACR降低,OCR升高。4 c-Myc可以结合于HnRNPAl的启动子区域促进HnRNPAl的转录。在U87和U251细胞中下调c-Myc后,HnRNPAl和PKM2表达下降,培养基中葡萄糖剩余量升高、乳酸生成量降低,EACR降低,OCR升高。回复实验中,sh-Myc的抑瘤作用可以被HnRNP Al质粒回复。5 Let-7a可以靶向结合于c-Myc的3’UTR区抑制c-Myc的表达。在U87和U251细胞中上调1et-7a后,Myc、HnRNPAl和PKM2表达下降。回复实验中,let-7a的抑瘤作用可以被c-Myc质粒回复。6 HnRNPAl可以反馈抑制Drosha酶介导的let-7a生成。7 裸鼠皮下肿瘤免疫组化实验进一步证实let-7a对c-Myc、HnRNPAl和PKM2表达的抑制作用。研究结论：1 let-7a通过抑制PKM2的表达影响胶质瘤细胞增殖和糖代谢能力。2 let-7a/c-Myc/HnRNPAl形成反馈环路调控PKM2表达而影响胶质瘤细胞的糖代谢和生长能力。