中国大鲵主要病害病原学与诊断技术研究

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中国大鲵(Andrias davidianus)俗名“娃娃鱼”,是我国珍稀的名贵特产,属于国家二级保护动物,已被列入CITES公约附录Ⅰ中。近年来,大鲵的人工繁育与养殖在陕西、浙江、湖南、湖北、贵州等省份发展迅速,已经形成具有重大经济价值的产业。然而,随着养殖规模的不断扩大,以及养殖集约化程度的不断提高,养殖大鲵的病害问题日趋严重,给大鲵养殖产业造成了巨大的经济损失。  本研究从患病的养殖大鲵体内分离到一株致病菌JZ01,经人工感染健康大鲵,可复制出与自然发病相同的症状,且从人工感染病鲵体内再次分离到相同的细菌。该致病菌对鲫鱼也有一定的致病性。经Biolog微生物自动鉴定系统的鉴定,以及进一步的16S rDNA基因序列和系统发育分析都表明,此致病菌为弗氏柠檬酸杆菌。药物敏感性试验表明,该菌对氨曲南、头孢三嗪、先锋噻肟等9种药物高度敏感。  本研究对大鲵虹彩病毒的理化特性及生物学特性进行了研究。结果表明:GSIV对热处理敏感,56℃和65℃处理30 min,均可彻底灭活病毒;GSIV经酸(pH3)和碱(pH10)处理,病毒滴度(TCID50/0.1 mL)与对照组相比较分别下降了8.58、9.04个对数级,差异极显著(P<0.01);GSIV经有机溶剂氯仿、乙醚以及胰蛋白酶处理,病毒滴度与对照组相比较分别下降了9.33、7.83、6.49个对数级,差异极显著(P<0.01)。冻融次数对GSIV滴度的影响不显著(P>0.05)。GSIV对细胞培养物的感染性试验结果表明, GSIV可在鲤上皮瘤细胞系( Epithelioma papilloma cyprini,EPC),斑点叉尾鮰肾脏细胞系(Channel catfish kidney,CCK),虹鳟鱼性腺细胞系(Rainbow trout gonadal,RTG-2)等细胞中增殖,但在EPC、CCK细胞中增殖速度快,病毒滴度高;GSIV在EPC细胞中的最适生长温度是25℃。GSIV在EPC细胞中增殖动态试验结果表明,GSIV感染细胞6 h后病毒滴度开始快速上升,进入对数增长期,72 h时病毒滴度达到最大值,以后趋于稳定。GSIV感染EPC细胞超薄切片透射电镜观察结果显示,在EPC细胞质中可见大量虹彩病毒样颗粒,呈晶格状排列,直径约140 nm。  本研究开展了大鲵虹彩病毒MCP基因全长克隆、原核表达、多克隆抗体制备与免疫诊断技术研究。根据大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白(GSIV-MCP)基因序列设计引物,PCR扩增得到 MCP基因编码框全长序列1392 bp,将其克隆至原核表达载体pET-32a中,构建了重组原核表达载体pET-32a-MCP,并在大肠杆菌BL21中得到了表达,融合表达的重组蛋白分子量约为70 kDa,与预期大小一致,主要以包涵体的形式存在。对IPTG浓度,诱导温度等诱导表达条件进行优化,确定0.5 mmol/L的IPTG于37℃的条件下诱导6 h重组蛋白的表达量最佳。纯化重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备了多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1:50000。Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接荧光免疫结果表明:该抗体可以对感染EPC细胞的GSIV及患病大鲵肾脏组织中GSIV进行特异性的检测。
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