论文部分内容阅读
鸭肠炎病毒(DEV),又称鸭疱疹病毒I型,是鸭、鹅及天鹅等雁形目水鸟的一种重要病原体,可引起急性、接触性传染的鸭病毒性肠炎(DVE),该病在家养及野生水禽中可造成高死亡率及产蛋下降。DEV基因组DNA序列的测定工作直到最近2年才陆续完成,而其编码基因的确定大多仅停留在与其他疱疹病毒同源基因的序列分析基础上,对蛋白编码基因的探索有助于我们更好地了解该病毒的生物学特征。为此,本研究开展了DEV UL15和UL41基因及其编码蛋白的鉴定和分析工作。DEV UL15由2个外显子和1个3.5 kb的内含子组成,其编码序列可转录2个转录本:全长的UL15及N-末端截断的UL15.5。2.9 kb的UL15转录本编码一739个氨基酸的蛋白质,其分子量大小约为82 kDa,而UL15.5转录本长约1.3 kb,包含888 bp的ORF,该ORF编码一大小约为32 kDa的多肽。序列分析表明UL15编码序列在疱疹病毒科内高度保守,并且含有2个在疱疹病毒及噬菌体末端酶催化亚基序列中保守的Walker A (261VPRRHGKT267)和Walker B (354LLFVDE359)基序。基于23个疱疹病毒UL15的氨基酸序列构建的系统发育树表明DEV与α疱疹病毒亚科,Mardivirus病毒属内病毒亲缘关系较近。此外,DEV UL15的转录和表达对放线菌酮(CHX)和膦乙酸(PAA)均敏感,说明UL15在DEV复制过程中晚期表达。Western blot结果显示,抗UL15C232的抗血清可在DEV感染的细胞内检测到UL15和UL15.5的表达,而在纯化的病毒粒子中检测不到蛋白的存在。间接免疫荧光结果显示,在感染早期(6 hpi) UL15定位在CEF细胞的细胞质中,到12 hpi和24 hpi时则转运进入细胞核,而在无其他病毒蛋白参与下,UL15则滞留在细胞质内。UL41的同源蛋白编码病毒宿主关闭蛋白(VHS),可非特异性的降解宿主及病毒mRNA。PSI-BLAST搜索显示,DEV UL41氨基酸序列具有核酸酶家族蛋白特征,且模拟的3D空间结构也与T4 RNase H和Taq DNA聚合酶的活性区域很好的叠合。此外,基于UL41氨基酸序列构建的系统发育树分析发现DEV与Mardivirus内病毒亲缘关系较近。为进一步分析编码蛋白特性,将UL41 ORF克隆至表达载体pMAL-c4x中,原核表达了可溶性全长融合蛋白MBP-UL41,并制备了抗UL41的抗血清。随后的体外VHS活性检测发现,融合蛋白具有RNase活性。CEF细胞内瞬时表达的UL41可致共转染的报告基因Luc表达量降低,证实了细胞内表达的UL41蛋白的RNase活性。此外,时序性分析发现UL41基因的表达对CHX敏感,而对PAA不敏感,说明UL41是早期表达基因。Western blot结果显示,DEV感染的细胞内可检测到UL41蛋白的存在,DEV病毒粒子中也含有UL41蛋白。在DEV感染的CEF细胞内,UL41定位在细胞质的核周区域,感染早期呈颗粒性聚集分布。在pcDNA-UL41转染的细胞中,瞬时表达的UL41主要位于细胞质的核周区域,细胞核中也有少量分布。最后,UL41蛋白上的保守性氨基酸残基的单点突变可导致蛋白的VHS活性的降低或丧失。综合突变分析及同源蛋白预测的结果推测,D253和D299可能是蛋白上的一个配体结合位点。综上所述,本研究鉴定了DEV的UL15和UL41基因和/或其编码的蛋白,为明确DEV病毒在疱疹病毒科的分类地位以及阐明这2个蛋白在DEV感染中的作用提供了实验数据。