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核糖体RNA(ribosomal RNA,简称rRNA)是所有生物体细胞中含量最多的一种RNA分子。rRNA与核糖体蛋白一起组成蛋白质合成的机器—核糖体,是维持生命必不可少的分子。细菌细胞中的rRNA包括23S rRNA、16S rRNA和5S rRNA。之前的研究发现,在大肠杆菌等细菌中,编码rRNA的基因成簇存在,成熟的23S、16S和5S rRNA由一个共同的rRNA前体分子通过核糖核酸酶(Ribonuclease,简称RNase)的剪切加工形成。基因组测序和基因注释结果显示,在十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestrs pv.campestris,Xcc 8004菌株(以下简称Xcc8004)基因组中,有2个rRNA基因簇。因此,Xcc8004成熟的rRNA是由这两个基因簇转录产生的rRNA前体经过RNase的剪切加工形成。但是,Xcc rRNA转录后加工过程以及参与rRNA剪切加工的RNase还不清楚。本研究的目的是鉴定参与Xcc8004 5S rRNA剪切加工的RNase。我们首先用Northern杂交的方法检测了 Xcc8004的成熟5S rRNA及其剪切加工产物。Northern杂交结果显示,在Xcc8004的总RNA中,除了一条119nt的成熟5SrRNA主带外,还检测到几条小于119nt的次条带,其中一条大约为100nt的剪切产物带信号最强,我们称之为“5S rRNA主剪切产物”。我们推测这个主剪切产物是由成熟的5S rRNA经RNase的剪切而来。为了鉴定参与5S rRNA剪切的RNase,我们用Northern杂交检测了 20个RNase基因(Xcc8004基因组共有22个RNase基因)的突变体中5S rRNA的剪切产物。结果发现,编码核糖核酸酶D(RNaseD)的基因(rnD)突变体中,≈1OOnt的主剪切产物带消失,说明RNaseD是这个主剪切产物的产生有密切关系。接着,我们构建了 rnD突变体的互补菌株以及rnD的过量表达菌株。Northern杂交结果显示,在互补菌株中,5S rRNA的主剪切产物得到了恢复;而在过量表达菌株中,5S rRNA的剪切明显加强了。这些结果证明,RNaseD在5SrRNA的剪切中起重要作用。为了明确RNaseD是否直接参与了 5S rRNA的剪切,我们分别纯化了RNase D蛋白和5S rRNA,并在体外检测了 RNase D蛋白对5S rRNA的剪切作用。结果表明,RNaseD能直接剪切5S rRNA。由于之前的研究表明,RNase D是细菌tRNA加工的关键酶,为此,我们在体外检测了 RNase D蛋白对来自Xcc8004的两个Met-tRNA(XC4335和XC4339)的剪切作用。结果显示RNase D能剪切这两种tRNA。说明Xcc8004的RNase D既能剪切5S rRNA也能剪切tRNA。为了弄清rnD基因的生物学功能,我们检测和比较了野生型菌株、rnD突变体和rnD突变体的互补菌株的胞外多糖产生、胞外酶活性、细胞运动能力、生物膜形成能力和致病力等表型。结果发现,rnD突变导致胞外多糖产量下降,而这一表型能被rnD基因反式互补;证明rnD基因与Xcc8004的胞外多糖的产生有关。本研究首次发现RNase D具有剪切5S rRNA的功能,拓展了人们对RNase D功能的认识。