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目的探索日本鸢尾水提物和醇提物作用于临床对β-内酰胺类抗生素耐药的大肠埃希菌后,该菌株对β-内酰胺类抗生素敏感性的变化。并对其作用机制进行初步探讨,为开发新型抗耐药菌感染的药物提供实验依据。方法①分别采用煎煮法、乙醇回流法提取日本鸢尾中的鸢尾苷,然后将提取的粗品分别采用大孔树脂吸附技术进行纯化,制备日本鸢尾水提物和醇提物样品。将制备的日本鸢尾水提物和醇提物样品分别采用呈色反应、氨水反应、三氯化铝反应、盐酸-镁粉反应试验进行黄酮类物质的定性;以鸢尾苷标准品作为对照,采用紫外分光光度法对样品中鸢尾苷含量进行测定。②采用E-test法测定183株大肠埃希菌对青霉素G和头孢噻肟钠的耐药性,采用PCR法对大肠埃希菌主要ESBLs基因型(TEM、CTX-M、SHV、KPC)进行分析。③采用微量试管稀释法测定日本鸢尾提取物对183株大肠埃希菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。④采用微量试管稀释法分别测定亚抑菌浓度的鸢尾水提物(终浓度分别为250 mg/mL、125 mg/mL和62.5 mg/mL)和鸢尾醇提物(终浓度分别为 100 μg/mL、50 μg/mL 和 25 μg/mL)作用 0.5 h 后,E001(TEM+)、E002(CTX-M+)、E003(KPC+)、E004(SHV+)、E005(TEM+)、E006(CTX-M+)、E007(CTX-M+)、E008(TEM+)、E009(SHV+)、E010(TEM+)这 10 株仅含单个 β-内酰胺酶基因的大肠埃希菌对青霉素G和头孢噻肟钠敏感性的变化。⑤1/4 MIC浓度青霉素G和头孢噻肟钠对大肠埃希菌TEM、SHV、CTX-M、KPC单基因表达的诱导作用,及鸢尾提取物对该抗生素诱导上述单基因表达的阻断作用,采用实时荧光定量RT-PCR 检测。结果①对日本鸢尾水提物和醇提物进行黄酮类定性分析,呈色反应、氨水反应、三氯化铝反应、盐酸-镁粉反应结果均显示阳性。全波长扫描得出鸢尾苷在266.5 nm波长处有最大吸收峰,以鸢尾苷标准品为对照,266.5 nm波长下紫外分光光度法进行定量,测得鸢尾水提物和醇提物样品中鸢尾苷含量分别为11.12%和36.75%。②E-test法测得,青霉素G对183株β-内酰胺类抗生素耐药大肠埃希菌临床菌株MIC≥32μg/mL,头胞噻肟钠对183株大肠埃希菌MIC≥16 μg/mL,该测定结果与各医院微量稀释法测定结果基本一致,说明各分离菌株对青霉素G和头孢噻肟钠均具有耐药性。PCR扩增结果显示,在183株对β-内酰胺类抗生素耐药的大肠埃希菌临床菌株中均可检出KPC、TEM、CTX-M和/或SHV基因,其中TEM基因检出率最高,为83.1%。(152/183),CTX-M基因次之 77.1%(141/183),SHV 基因为 8.2%(15/183),KPC 最低 2.2%(4/183),可见,TEM和CTX-M基因检出率显著高于SHV和KPC基因。其中31.7%(58/183)菌株携带KPC、TEM、CTX-M或SHV单基因,68.3%(125/183)菌株携带两种以上ESBLs基因,两种以上ESBLs基因检出率显著高于ESBLs单基因检出率。携带两种以上ESBLs基因菌株中,92.0%(115/125)菌株同时携带TEM和CTX-M基因(TEM+CTX-M),明显高于 TEM+SHV(4.8%,6/125)或 TEM+CTX-M+SHV(3.2%,4/125)基因携带模式。鉴于单基因菌株相对于多基因菌株基因表达机制相对单纯、清晰,我们选取了E001(TEM+)、E002(CTX-M+)、E003(KPC+)……E010(TEM+)这 10 株单基因菌株分别研究日本鸢尾水提物和醇提物对耐药大肠埃希菌的抗生素敏感性的影响;选取了E001(TEM+)、E002(CTX-M+)、E003(KPC+)和 E004(SHV+)菌株检测鸢尾提取物对TEM、SHV、CTX-M、KPC单基因表达的影响。③微量稀释法测定日本鸢尾提取物对183株大肠埃希菌的杀菌作用,发现水提物的MIC≥500 mg/mL,MBC≥1000 mg/mL;醇提物的MIC≥200 μg/mL,MBC≥400 μg/mL。我们选取亚抑菌浓度即250 mg/mL、125 mg/mL和62.5 mg/mL为鸢尾水提物的工作浓度,选取100 μg/mL、50 μg/mL和25 μg/mL为鸢尾醇提物的工作浓度,研究提取物对耐药菌株抗生素敏感性的变化,及耐药基因的表达提供依据。④250 mg/mL鸢尾水提物或125 μg/mL鸢尾醇提物作用0.5 h 后,测得 E001(TEM+)、E002(CTX-M+)、E003(KPC+)……E010(TEM+)这10株菌株中,只有E003(KPC+)对青霉素G和头孢噻肟钠的耐药不变,其余9株都由耐药变为敏感。如青霉素G对E001、E004、E006、E009菌株MIC均由32 μg/mL变为8 μg/mL;对 E002 和 E005 菌株的 MIC 均由 32 μg/mL 变为 4 μg/mL;对 E007 和 E010菌株的MIC均由64 μg/mL变为16 μg/mL;对E008菌株的MIC由128 μg/mL变为16μg/mL,说明250 mg/mL鸢尾水提物或100 μg/mL鸢尾醇提物都能增强对β-内酰胺类抗生素耐药的大肠埃希菌株对青霉素G和头孢噻肟钠的敏感性。而125mg/mL鸢尾水提物和50 μg/mL鸢尾醇提物仅能改变1或2株细菌对青霉素G的敏感性,但能改变5株细菌对头孢噻肟钠的敏感性。而62.5 mg/mL鸢尾水提物和25 μg/mL的鸢尾醇提物对10株耐药菌的抗生素敏感性几乎没有影响。⑤16S RNA作内参,与空白对照相比,1/4 MIC浓度的青霉素G和头孢噻肟钠都能使TEM、SHV、CTX-M基因相对mRNA水平升高10倍以上,说明1/4 MIC浓度的抗生素能够诱导大肠埃希菌耐药基因表达量升高。而250 mg/mL鸾尾水提物和100μg/mL或50 μg/mL鸾尾醇提物能使抗生素诱导升高的基因表达量下降40%以上,说明此浓度鸢尾提取物能够阻断抗生素诱导ESBLs单基因的表达。结论微量试管稀释法测得鸢尾水提物和醇提物的MIC分别为≥500 mg/mL和≥200μg/mL。我们选择亚抑菌浓度,即250 mg/mL、125 mg/mL和62.5 mg/mL为鸢尾水提物的工作浓度,100 μg/mL、50 μg/mL和25 μg/mL为鸢尾醇提物的工作浓度。抗生素敏感性增强实验中,我们发现250 mg/mL的鸢尾水提物和100 μg/mL或50 μg/mL的鸢尾醇提物能够增强耐药大肠埃希菌对青霉素G或头孢噻肟钠的敏感性。单一耐药基因表达量检测实验中,我们发现250 mg/mL的鸢尾水提物和100 μg/mL或50 μg/mL的鸢尾醇提物能够阻断1/4MIC浓度青霉素G或头孢噻肟钠诱导TEM、SHV、CTX-M基因相对mRNA水平升高。因此,我们得出结论:鸢尾提取物可能是通过阻断抗生素诱导耐药大肠埃希菌TEM、SHV、CTX-M单基因的表达,从而增强耐药大肠埃希菌对青霉素和头孢噻肟的敏感性。