随着激素在临床上广泛应用,激素性股骨头缺血性坏死(steroid-induced avascular necrosis of femoral head,SANFH)已成为非创伤性股骨头坏死的主要原因,且有逐年增高的趋势。然而,SANFH的发病机制尚不明确,国内外研究者纷纷从分子、基因水平对SANFH发病机理进行深入研究。然而,细胞的功能是由蛋白质完成,蛋白质是疾病发生、发展、转归的执行者和参与者,也是疾病进程的信号。随着后基因组时代序幕的开启,蛋白质组学掀起了高潮,该技术已经广泛运用于骨科疾病的研究,虽然还处于起步阶段,但将蛋白质组学运用于SANFH研究不失为一种新方法与新模式。目前为止,对蛋白质分子与激素摄入致股骨头坏死的动态研究,未见报道。本研究首先运用三种常用方式建立SANFH模型:①内毒素与激素联合应用;②单纯应用激素;③马血清与激素联合应用;通过比较三种方式的建模时间、成功率、骨坏死发生率等,以期寻找出适合于早期SANFH蛋白质组研究的理想动物模型。通过比较最终选择内毒素联合激素方法制作早期兔SANFH模型,并采集不同时间点(2周、4周、6周)的病变股骨头与正常股骨头组织。通过比较常规蛋白质提取法、透析法、丙酮沉淀法,寻找理想的提取骨组织蛋白质样品方法,并对提取的骨组织蛋白进行初次双向凝胶电泳,从而为今后SANFH的蛋白质组学分析提供前期研究基础。第一部分激素性股骨头缺血性坏死动物模型的建立本部分研究的目的是通过比较三种不同建模方式,寻找适用于兔早期激素性股骨头缺血性坏死蛋白质组研究的模型建立方法,为进一步运用蛋白质组学技术对该病的相关研究提供理论基础和实验依据。实验选择健康成年雄性新西兰白兔,根据给药方式不同随机分成4组。(1)A组即“内毒素+激素”组(n=12);(2)B组即“单纯激素”组(n=12):(3)C组即“马血清+激素”组(n=12);(4)D组即“对照”组(n=8)。处理后观察动物各种生活情况,进行血液学、组织病理学检查、透射电镜学观察以及计算各组骨坏死发生率。通过比较,大剂量甲基强的松龙联合小剂量内毒素能诱导出典型的兔早期股骨头缺血性坏死模型,成功率高,死亡率低,重复性好。第二部分激素性股骨头缺血性坏死蛋白质组学研究的前期探索分析本部分研究的目的是通过比较常规蛋白质提取法、透析法、丙酮沉淀法,寻找理想的制备骨组织蛋白质样品方法,并对提取的骨组织蛋白进行初次双向凝胶电泳,从而为后续蛋白质组学分析提供前期研究基础。实验对同一份兔骨组织标本采用常规蛋白质提取法、透析法、丙酮沉淀法分别提取蛋白,所提取的蛋白按相同上样量,同时经SDS-PAGE电泳、染色、脱色、扫描、分析,并对实验提取的骨组织蛋白进行初次双向凝胶电泳。通过比较,优化的丙酮沉淀方法所提取的骨组织蛋白电泳条带较清晰,蛋白条带也明显增多。从双向凝胶电泳图谱中观察到所得两块图谱中的蛋白质点分别为423个和468个,分布模式相似,说明重复性较好,可为今后SANFH的蛋白质组学研究提供相关的技术平台。结论1.小剂量内毒素联合大剂量激素能诱导出典型股骨头缺血性坏死。2.比较后认为丙酮沉淀法能满足目前骨组织蛋白的提取,而该方法尚有不足之处,因此仍期望能有更好的方法进行优化或替代。3.本项目拥有较好的蛋白质组学相关技术平台。