植物叶脉分布在叶肉组织中,对矿物质、水分和光合作用产物的运输及叶片的物理支撑起着重要的作用。水稻的叶脉为平行脉,分为中脉、大脉与小脉。小脉的密度(即单位叶宽的小脉数)对于光合作用产物的运输尤其重要,C4植物的小脉密度要比C3植物高,因此具有更快的光合产物转运速率。研究水稻小脉密度调控的分子机制不仅仅可以揭示维管束发生、发育等基础理论问题,更重要的是可以通过改造水稻小脉密度,甚至在水稻中创制类似C4植物叶片的解剖学结构,提高光合作用效率及光合产物转运速率,为C4水稻的创制打下坚实的基础。本论文以一份叶脉密度增加、维管束发育异常的类C4叶脉结构突变体为研究对象,通过图位克隆方法克隆控制该性状的基因TWI1,并对TWI1调控水稻叶脉发育的分子机理进行研究,主要结论如下:1、水稻野生型日本晴旗叶中部小脉密度为每2mm叶宽9个小脉,本研究从大容量T-DNA插入突变体库中筛选获得了一份旗叶中部小脉密度为每2mm叶宽14个小脉的突变体,由于叶片同时表现为卷曲,将其命名为twi1(twisted-leaf1)。该突变体叶片解剖学结构表现为叶脉增密、两个维管束之间的叶肉细胞数减少,维管束鞘细胞大而数目少,内束鞘细胞缺失,非常类似C4植物的“花环结构”。组织解剖学研究表明twi1突变体在维管束形成时候的木质化进程发生异常,从而导致形成发育不完全的叶脉结构。2、利用图位克隆法克隆到TWI1基因,该基因编码一个由591个氨基酸组成,含有RCD-SRO-TAF4保守结构域的自由基诱导细胞死亡蛋白;基因测序结果表明,twi1突变体中该基因第一个外显子发生单碱基替换(T-A)产生终止密码子,导致蛋白翻译提前终止。TWI1为转录因子结合蛋白,亚细胞定位实验表明该蛋白定位于细胞核和细胞质中。表达模式分析发现该基因在幼苗期植株和成熟期的根、茎、叶、花和颖壳均有表达,并且在幼苗期和成熟期的叶片表达量较高。突变体互补实验中,TWI1可以完全恢复twi1突变体表型,进一步验证了该基因的功能。3、利用酵母双杂交筛库获得了TWI1互作蛋白OSH15,并利用双分子荧光互补和免疫共沉淀在植物体内证明TWI1与OSH15的体内相互作用。对基因TWI1和OSH15的不同功能域分别进行酵母点对点互作分析,结果表明,TWI1的RST功能域和OSH15的HD功能域是TWI1和OSH15互作的核心功能域,负责两个蛋白的相互作用。蛋白2A自剪切系统注射烟草实验表明,OSH15蛋白可以穿梭移动到相邻细胞,同时TWI1通过和OSH15相互作用而抑制其移动功能。同时拟南芥根毛拯救实验结果显示,GL1-OSH15融合蛋白可以从突变体gl1叶肉细胞中移动到表皮细胞,互补其叶毛缺失表型,再次证明OSH15具有细胞间穿梭移动功能,并且共表达TWI1转基因株系中OSH15移动能力被抑制。4、利用免疫组化实验研究了OSH15蛋白在野生型和twi1组织内分布情况,结果表明,OSH15蛋白在野生型中仅在顶端分生组织叶原基部位存在,而突变体中OSH15蛋白不仅在顶端分生组织弥散分布,同时在叶片也有存在,证明OSH15蛋白在twi1突变体中穿梭移动到叶片内,导致twi1突变体出现叶片维管束异常发育的表型。对twi1/osh15双突变体以及twi1/RST、twi1/OSH15-RNAi转基因株系观察发现,其叶片表型分别完全、部分恢复,该结果从遗传学上证明TWI1通过和OSH15互作来调控OSH15蛋白功能,影响水稻叶片木质素产生和维管束细胞的特异分化模式,进而调控水稻叶脉的起始和发育以及叶脉解剖学结构和密度。