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背景：20世纪80年代后期以来,伴随人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的流行、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)耐药、耐多药菌株的增加以及流动人口的增加等原因使全球结核病发病率呈回升趋势,尤其是结核菌耐药问题使结核病治疗更是雪上加霜。结核病负担重的主要原因在于检测方法的不恰当和治愈率低,痰涂片是作为活动性结核病简单又快速的检测方法,仅适用于细菌量大于104的痰样本,因此大多数病人都是涂阴肺结核(smear-negative pulmonary tuberculosis,SNP-TB)病人。SNP-TB虽然在传染性的强度上低于涂阳肺结核,但是它在结核病的传播和致病方面,也是不可忽视的。目前涂片阴性和潜伏感染的肺结核病人检测成为结核病预防、控制和治疗的一大难题。如果涂片阴性结核病人没有得到及时诊断、发现和治疗,将导致结核病进一步传播,防治工作仍面临更多挑战。因此,迫切需要新的快速、敏感、高效的SNP-TB病诊断、鉴别诊断新方法。反向斑点膜杂交(reverse dot blot hybridization,RDBH)技术包括DNA探针、核酸杂交、酶联显色3方面,可用于检测SNP-TB病人痰标本中的结核分支杆菌及其对多个药物的耐药性情况,这一技术主要从基因组学方面研究结核病。而基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-fight mass spectrometry, MALDI-TOF/MS)作为蛋白质组学研究的核心技术,可通过检测血清样本蛋白多肽表达图谱,筛选出SNP-TB病、肺炎和健康对照组之间的差异蛋白,为临床寻找结核病血清标志物提供理论依据。本研究将利用膜芯片技术检测SNP-TB病人痰液中的结核杆菌及其耐药情况,同时利用质谱筛选出SNP-TB病人的血清潜在标志物。目的：探讨PCR-膜芯片技术检测结核杆菌及其耐药情况的可行性,同时利用定量蛋白组血技术筛选出SNP-TB病人的血清潜在标志物。方法：1、通过PCR-膜芯片检测痰标本(50例涂阴结核及18例非结核)中的结核杆菌IS6110基因和其耐药基因,结果分别与抗酸染色涂片镜检及药敏试验结果进行分析比较；2、使用安捷伦多重亲和去除系统(Multiple Affinity Removal System, MARS)-Human14液相色谱柱去除血清的14种干扰高丰度蛋白,并浓缩低丰度蛋白后,利用可以进行相对和绝对定量的稳定同位素(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)113、119、121标记、强阳离子交换柱(strong cation exchange column, SCX)分离、反相色谱柱分离结合MALDI-TOF/MS技术检测70例血清标本：30例痰涂片阴性的结核病人、10肺炎病人及30例正常对照的血清,分析血清蛋白峰,筛选疾病相关潜在生物标志物,并使用进行生物信息学分析软件进行分析；结果：1、PCR-膜芯片检测68例痰标本中的结核杆菌IS6110基因,在50例痰涂片阴性的结核患者中,PCR-膜芯片检测的阳性率达76.0%(38/50)。PCR-膜芯片检测痰涂片阴性的结核患者的阳性率显著高于痰涂片检查。痰涂片和PCR-膜芯片检测18例非结核标本的特异度均为100%(18／18)；2、PCR-膜芯片直接检测38例结核杆菌IS6110基因阳性的痰标本中的结核杆菌耐药基因,结果显示5例存在耐药基因突变,提示可能存在INH,RFP,SM的耐药情况；其中2号样本耐药基因突变提示存在INH、RFP、SM耐药性,与痰培养+药敏试验的结果完全一致；三例由于培养阴性无法提供药敏结果,1例膜芯片检测结果与药敏试验不同。3、经过对比三次独立重复实验的结果,发现除了载脂蛋白A Ⅰ和补体蛋白C3,MARS柱有效地去除了血清中的12种高丰度蛋白；利用iTRAQ标记结合MALDI-TOF/MS的定量血清蛋白组学技术,对SNP-TB、肺炎、正常对照血清蛋白组进行研究,共筛选和鉴定到344个蛋白质,其中271种蛋白质置信度在95%以上；与正常人血清蛋白表达谱相比,13种蛋白表达水平在SNP-TB中显著增高(P<0.05),34种蛋白和2种蛋白在肺炎血清中分别表达上调和下调(P<0.05)。4、比较SNP-TB、肺炎血清蛋白组,共发现13个显著性差异蛋白,其中4个蛋白的表达水平SNP-TB／肺炎均>2,它们分别是纤连蛋白、抗凝血酶-Ⅲ、组氨酸丰富的糖蛋白、a2-抗纤维蛋白溶酶；5、对13个差异蛋白GO分类分析发现,大部分差异蛋白主要参与对应激的反应、生物调节和免疫系统过程；通过STRING蛋白-蛋白相互作用网络分析发现,纤连蛋白(FINC)、抗凝血酶Ⅲ (ANT3)、组氨酸丰富的糖蛋白(HRG)、a2-抗纤维蛋白溶酶(A2AP)在相应网络中和超过4个以上差异蛋白质发生相互作用,是整个网络的关键性节点。结论：1、利用PCR-膜芯片技术能直接检测SNP-TB病人痰样标本中的结核杆菌及其耐药基因突变,有较高的特异性和敏感性；2、MARS柱能去除血清绝大部分高中丰度蛋白的同时也保留了更多的小分子量蛋白,适合于质谱分析前血清的处理。3、iTRAQ标记结合MALDI-TOF/MS技术蛋白质谱技术标本用量少,可直接快速地检测血清标本,而且高灵敏度、高特异度和重复性好,是进行疾病血清差异蛋白筛选研究的理想平台；4、主要参与脂类和血管代谢途径的纤连蛋白、抗凝血酶-Ⅲ、组氨酸丰富的糖蛋白、a2-抗纤维蛋白溶酶可能是结核相关的潜在标志物,可能为以后SNP-TB病的诊断和鉴别诊断提供依据和奠定基础；