前言黏附分子Catenin家族中的p120ctn和β-catenin与肺癌侵袭、转移的关系已有报道,但该家族中的另一成员8-catenin与肺癌的侵袭、转移是否有关尚不清楚。与p120ctn一样,8-catenin既可与E-cadherin的JMD (juxtamembrane domain)位点结合,入核后也可与转录抑制因子Kaiso结合。这些信息提示我们,8-catenin在肿瘤的恶性表型中可能同样扮有重要角色。Burger等报道与良性前列腺增生相比,前列腺癌中8-catenin的转录明显上调,其蛋白表达也显著增加。然而,肺癌组织中8-catenin的表达情况如何、8-catenin的表达与非小细胞肺癌(NSCLC)临床病理因素之间存在怎样的关系尚不清楚,8-catenin和p120ctn与E-cadherin分子中JMD位点的结合是否存在竞争性等也需要证实。最初认为8-catenin只表达于大脑神经元,且可与presenilin 1结合,参与早老性痴呆(Alzheimer’s disease)的发生发展。后又发现8-catenin对于神经元突触功能的维持很重要,并可作为支架蛋白而参与信号向下游的传递等。有文献显示,在MDCK细胞中过表达8-catenin可以改变细胞形态,包括诱导层形足板的形成等。最近又有文献报道,8-catenin作为一个上游刺激信号的整合子可以促进下游Rho活性的降低以及Cdc42和Rac活性的升高,从而导致了突起的形态变化。我们知道小GTPases是细胞骨架重构、信号转导和基因表达通路的重要调节因子,我们也发现p120ctn通过小GTPases而影响肺癌细胞的侵袭和转移。因此,我们推测8-catenin与肿瘤侵袭和转移之间很可能存在着联系。在本研究中,我们检测了115例NSCLC样本中8-catenin、p120和E-cadherin的表达情况并探讨了它们的表达与临床病理因素的关系。同时,在肺癌细胞系中分别过表达或干扰8-catenin和p120ctn,并借助免疫共沉淀的方法探讨了两者是否存在与E-cadherin的竞争性结合以及δ-catenin对肺癌细胞小GTPases活性和生物学行为的影响。材料与方法一、组织标本与病人资料115例NSCLC患者的标本及20例癌旁正常肺组织(距原发性肿瘤边界5cm以上)标本收集自中国医科大学第一附属医院病理科1998～2005年存档蜡块。115例标本中包括50例淋巴结转移癌标本作为配对研究,其余65例标本具有完全随访资料。所有病例术前均未接受放疗和化疗。男性61例,女性54例,男女性别比1.1：1,年龄33～80岁(中位年龄58岁)。按照International Union Against Cancer (UICC)于2002年修订的肿瘤pTNM分期标准：Ⅰ期18例,Ⅱ期39例,Ⅲ期56例,Ⅳ期2例。按照World Health Organization (WHO)肺癌分类标准：鳞癌54例,腺癌61例。为了验证免疫组化的结果,我们另外收集了30例新鲜肺癌及癌旁正常肺组织用于检测δ-catenin蛋白和mRNA的表达情况。二、免疫组织化学染色采用Streptavidin-Peroxidase (SP)免疫组织化学方法进行染色,检测δ-catenin、p120和E-cadherin在115例NSCLC标本中的表达及其与各临床病理因素之间的关系,也检测了其中50例原发灶与转移灶配对的标本中δ-catenin表达的差异以及另65例随访标本中δ-catenin表达与患者预后的关系。三、细胞培养,质粒构建与转染人肺腺癌细胞系A549和SPC-A-1(以下称SPC)培养于含10% FBS的RPMI1640培养基中。将δ-catenin质粒(pCMV5-FLAG/8-catenin)导入δ-catenin表达较低的SPC细胞系；选择干扰效果较好的δ-catenin siRNA序列导入δ-catenin表达较高的A549细胞系。将p120ctn-1A和3A质粒导入p120ctn中等量表达的A549细胞系和稳定干扰p120ctn的SPC细胞系；采用我们已经报道的p120ctn siRNA质粒和方法将该质粒导入A549和SPC细胞系。四、Western Blotting与RT-PCR应用Western Blotting与RT-PCR检测肺癌及癌旁正常肺组织中δ-catenin的蛋白和mRNA表达情况。五、免疫共沉淀为了验证δ-catenin和p120ctn是否竞争性地与E-cadherin上的相同位点JMD结合,我们在SPC和A549肺癌细胞系中既过表达δ-catenin或p120ctn,又敲除内源性δ-catenin或p120ctn后通过免疫共沉淀方法观察它们与E-cadherin的结合情况。参照Dai SD等所描述的条件,取等量总蛋白与E-cadherin抗体在4℃条件下孵育过夜。使用ProteinG beads捕获免疫复合物,随后进行Western Blotting检测。六、免疫荧光染色细胞系经固定、封闭后,分别与δ-catenin、p120ctn和E-cadherin抗体孵育过夜。随后滴加FITC(或TRITC)标记的山羊抗小鼠荧光二抗,Hoechst 33258复染核。七、RhoA,Cdc42和Racl活性的检测我们通过Pull-Down和比色法测定过表达或敲除δ-catenin后肺癌细胞small GTPases (RhoA、Cdc42、Racl)活性的变化,以便阐释δ-catenin对肺癌细胞恶性表型影响的机制。八、细胞周期、细胞增殖与细胞侵袭能力的测定为了观察δ-catenin对肺癌细胞生物学行为的影响,我们分别过表达与敲除δ-catenin后,利用FCM(流式细胞)、MTT、基质胶侵袭试验和免疫荧光(F-actin染色)来检测细胞周期、细胞增殖能力、细胞侵袭能力和细胞骨架的变化。结果一、δ-catenin在肺癌组织中高表达并与患者的不良预后相关δ-catenin在正常支气管上皮细胞和黏膜下腺体细胞的胞浆中呈现弱的信号(阴性表达)。在肺癌组织中δ-catenin的阳性信号定位于胞浆,其阳性表达率为62.61%(72／115),明显高于正常肺组织的表达水平(P<0.001)。肺腺癌中的阳性表达率明显高于鳞癌(P<0.05)；Ⅲ-Ⅳ期的阳性表达率显著高于Ⅰ-Ⅱ期(P<0.05)；有LN转移的病例阳性表达率也明显高于无LN转移的病例(P<0.05)。50例LN转移的配对研究表明：δ-catenin在LN转移灶中的表达明显高于其相应原发灶的表达(P<0.05)。连续切片的免疫染色显示,p120ctn和E-cadherin在正常支气管上皮细胞中主要定位于胞膜,而在肺癌组织中主要定位于胞浆(异常表达),且p120ctn和E-cadherin的异常表达率在高分期、低分化、有淋巴结转移的病例中明显增加(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析表明,δ-catenin阳性表达患者的平均生存时间短于阴性表达者(P=0.019)。正常肺组织中δ-catenin的mRNA和蛋白表达均低于配对的肺癌组织(P<0.05)。二、δ-catenin和p120ctn均可与E-cadherin在肺癌细胞胞浆中结合,但二者并不存在竞争关系过表达(或干扰)δ-catenin后,其与E-cadherin的结合量发生了相应的增加(或减少),但p120ctn与E-cadherin的结合并未发生明显变化；同理,过表达(或干扰)p120ctn后,其与E-cadherin的结合量发生了相应的增加(或减少),但δ-catenin与E-cadherin的结合也未发生明显变化。此外,免疫荧光染色显示E-cadherin、δ-catenin和p120ctn主要定位于胞浆。三、过表达δ-catenin下调RhoA活性,上调Cdc42和Racl的活性过表达δ-catenin后,总Cdc42和Rac1蛋白水平虽然没有变化,但其活性却明显增高(P<0.05),且RhoA活性明显下降(P<0.05)；而干扰δ-catenin后,总Cdc42和Rac1蛋白虽然也没变化,但其活性却显著降低(P<0.05),且RhoA活性增加(P<0.05)。四、过表达δ-catenin可改变肺癌细胞周期、促进增殖与侵袭FCM显示过表达δ-catenin后,G1期细胞的平均比例明显减少(P<0.05)；而S期和G2／M期细胞的平均比例显著增加(P<0.05)。当干扰内源性δ-catenin后,G1期细胞的平均比例显著增多(P<0.05)；而S期和G2／M期细胞的平均比例明显减少(P<0.05)。MTT显示过表达δ-catenin的肺癌细胞的增殖能力明显增强(P均<0.05),而干扰内源性δ-catenin组瘤细胞的增殖能力显著降低(P均<0.05)。免疫荧光和侵袭实验显示过表达δ-catenin后,细胞表面出现明显的丝状伪足(filopodia),且平均侵袭的细胞数明显增多(P<0.01)；而干扰δ-catenin后,actin在胞浆内均匀地重新排列,且平均侵袭的细胞数显著减少(P<0.01)。结论1、δ-catenin在肺癌组织中高表达并与患者的不良预后相关。2、δ-catenin和p120ctn均可与E-cadherin在肺癌细胞胞浆中结合,但两者不存在竞争关系。3、δ-catenin通过降低RhoA活性、升高Cdc42和Racl的活性以及改变细胞周期等方式而促进肺癌细胞的增殖与侵袭。