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天然免疫是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防线。在病毒入侵机体之后,宿主的模式识别受体(PRR,pattern recognition receptors)能够迅速识别来自病毒的病原相关分子模式(PAMP,pathogen-associated molecular patterns),并积极做出免疫应答。维甲酸诱导基因Ⅰ样受体家族(RLR,retinoic acid-inducible gene-Ⅰ(RIG-Ⅰ)-like receptors)是新近发现的RNA识别受体。RLR包括三个成员,分别是 RIG-Ⅰ,黑色素瘤分化相关抗原 5(MDA5,melanoma differentiation-associated gene 5)和遗传学和生理学实验室蛋白2(LGP2,laboratory of genetics and physiology 2)。RIG-Ⅰ和MDA5在识别外源RNA之后,可以通过一系列信号活化引起Ⅰ型干扰素及炎性细胞因子的大量表达,从而帮助机体迅速建立起应对病毒的状态。另一方面,MDA5和RIG-Ⅰ的过量表达及活化还能够引起自身免疫疾病及自身炎症疾病的发生。因此,MDA5及RIG-Ⅰ的表达及活化需受到精确调控,有关其精确调控方式与相关机制的研究是天然免疫领域的前沿热点。泛素化修饰是调节RIG-Ⅰ及MDA5分子表达及活性的重要的翻译后修饰(PTM,post-translation modification)之一。已知 TRIM25(tripartite interaction motif 25)、TRIM4、RNF135(RING finger protein 135)、MEX3C、RNF125、RNF122、c-Cbl 和 CHIP(carboxyl terminus of HSC70-interacting protein)能够通过对 RIG-Ⅰ进行K63位或K48位泛素化修饰而调节RIG-Ⅰ的活化或表达。然而,是否存在通过泛素化修饰从而调节MDA5的表达及活性的E3泛素连接酶目前尚不清楚;是否存在能够精确调控RLR表达的其他类型泛素化修饰也需要进一步明确。TRIM40是E3泛素连接酶TRIM家族成员之一。TRIM40定位于主要组织相容性复合体Ⅰ类基因区(MHC Ⅰ),与其他多个TRIM家族分子共同形成了一个紧密基因簇。多项研究表明,位于该基因簇的TRIM成员在天然免疫调节方面具有重要作用,包括TRIM15、TRIM26、TRIM31和TRIM39等。然而,TRIM40分子在天然免疫调节中是否发挥作用尚不清楚。在本文中,我们发现TRIM40缺陷能够特异性促进RNA病毒仙台病毒(SeV,Sendai virus)和水疱性口炎病毒(VSV,vesicular stomatitis virus)感染引起的 IFN-β及炎症因子的表达,而对LPS和poly(I:C)诱导的信号通路没有影响。对TRIM40缺陷细胞进行MDA5和RIG-Ⅰ特异性配体(长链和短链poly(I:C))转染,可发现IFN-β转录较野生型细胞均有上调。通过报告基因检测IRF3和NF-κB启动子区活性,及Western blot检测SeV感染后信号分子的磷酸化水平,发现TRIM40特异性抑制RLR介导的IRF3和NF-κB信号通路活化。RNA病毒感染后,TRIM40表达下调,说明TRIM40是抗病毒天然免疫反应中的反馈调节因子。体内实验发现,Trim40-/-小鼠腹腔注射SeV或VSV病毒后,能引起更强烈的天然免疫反应,且生存率显著提高。我们进一步对TRIM40作用机制进行了研究。通过向HEK293T细胞中高表达RLR信号通路中的相关信号分子进行报告基因实验发现,TRIM40的作用位点位于MAVS或MAVS上游。免疫共沉淀实验进一步确认TRIM40能够与MDA5和RIG-Ⅰ结合。利用截短体质粒及免疫共沉淀实验发现TRIM40可以通过其CC(coiled-coil)结构域与 MDA5 和 RIG-Ⅰ 的 CARD(caspase activation and recruitment domain)结构域结合。chase 实验证明 TRIM40 参与了 MDA5 和 RIG-Ⅰ的降解过程,同时MDA5和RIG-Ⅰ的降解过程可被蛋白酶体抑制剂逆转,说明TRIM40对底物的降解是通过蛋白酶体途径。二次免疫共沉淀检测MDA5及RIG-Ⅰ泛素化修饰情况,证实了 TRIM40能够直接催化MDA5和RIG-Ⅰ的K27位和K48位泛素化修饰。我们利用MDA5及RIG-Ⅰ CARD结构域截短体,证明了 TRIM40能够通过泛素-蛋白酶体途径降解MDA5及RIG-Ⅰ CARD结构域并下调RLR信号通路活化。为明确TRIM40对MDA5和RIG-Ⅰ的作用位点,我们构建了位于MDA5 CARD结构域上的点突变体,确定了 TRIM40催化MDA5的多聚泛素化修饰位点是K23、K43和K68。我们的研究揭示了 TRIM40通过介导MDA5、RIG-Ⅰ的K27位和K48位泛素化降解从而抑制RLR信号通路及IFN-β产生的分子机制;首次发现了 MDA5和RIG-Ⅰ的K27位泛素化并证实K27位泛素化修饰参与了蛋白酶体途径的降解;首次确定了 MDA5能够发生泛素化修饰的位点。我们的发现丰富了参与抗病毒天然免疫反应的调控网络的基础研究,也为抗病毒和自身免疫疾病的未来治疗提供了潜在的靶点与新思路。