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NF-κB是一种十分重要的转录因子,参与多种基因的表达调控,具有影响细胞的生长、分化、凋亡、癌变和个体发育等多种生物学功能。它的异常激活与肿瘤的发生,抗药性和肿瘤的转移相关,而抑制细胞内NF-κB的异常激活就可抑制肿瘤的发生、转移,降低肿瘤细胞对化疗或放疗的耐受性。因此,NF-κB是一种新型抗肿瘤药物筛选的靶分子。 本实验从人神经胶质瘤U251细胞中提取总RNA,通过RT-PCR方法得到人NF-κB P50全长基因(长1308bp,编码436个氨基酸);构建了重组表达载体pGEX-4T-P50;转入大肠杆菌后,在30℃,IPTG终浓度为0.2mM,诱导6hr,获得融合蛋白GST-P50(分子量约70kD),表达量占菌体总蛋白的30%,可溶性融合蛋白为总融合蛋白的1/5;纯化融合蛋白并免疫家兔获得了多克隆抗体,抗体经纯化并分装保存;Western印迹分析表明纯化后的多克隆抗体中已经无针对GST蛋白的抗体,而只具有较强的专一于P50蛋白的抗体;ELISA分析证实其效价为5×10~5。 本实验构建的酶标检测方法,经过摸索并确定了:GST-P50包被浓度为1μg/ml、包被体积为100μl,抗体的稀释度为1/1600,抗体与核蛋白样品的温育条件为37℃ 1hr,此时检测NF-κB活性的灵敏度最高,可达到ng级,足以检测出细胞中NF-κB活性的微量变化。 进一步利用检测模型来验证此酶标方法的优劣,实验组加入了100ng/mlLPS刺激U251细胞30min,细胞中NF-κB的活性就显著增高,1hr达到峰值,然后开始下降,6hr已经处于低水平的维持状态;当刺激时间同样维持在1hr,LPS的浓度分别为10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、60ng/ml、100ng/ml时,细胞中NF-κB的活性随剂量的增加而增高,用我们的酶标方法得到的检测结果(细胞内NF-κB活性变化趋势)与Wang X的报道一致,从而验证了本实验所建立的酶标方法具有特异性和实效性。该酶标方法的建立为判定NF-κB的活化程度、研究相关信号转导及筛选高效的NF-κB拮抗药物奠定了基础。