论文部分内容阅读
我们前期采用cDNA微阵列分析(cDNA microarray)和启动子甲基化检测发现ZIC1(Zinc finger of the cerebellum1)基因在胃肠癌细胞和组织中沉默表达或显著表达显著下调,这种低表达现象与启动子高甲基化相关。ZIC1基因是ZIC基因家族成员之一,定位于人类3号染色体长臂,具有三个外显子结构和Cys2HiS2锌指结构域,转录产物是重要的C末端锌指转录因子。近年来的研究表明,ZIC1基因除了在神经嵴和脑发育过程起重要作用外,还与髓母细胞瘤、子宫内膜癌、硬纤维瘤和脂肪肉瘤等肿瘤的发生发展密切相关。但有关ZIC1基因对胃癌肿瘤生物学行为的影响和相关分子机制未见文献报道。细胞增殖和细胞周期调控对胃癌发生发展起关键作用。已经证实Sonic hedgehog (Shh)信号通路与胃癌的发病机制联系密切,可以调控胃癌细胞的分化和增殖。MAPK和PI3K信号通路是调控细胞增殖的重要信号通路,这两条信号通路的激活还参与细胞周期特别是G1-S期的调控。本课题采用现代细胞与分子生物学技术,通过建立外源性过表达ZIC1的胃癌细胞系,了解胃癌发生中ZIC1基因对细胞增殖、细胞迁移及细胞侵袭等重要生物学功能的影响,并进一步探讨ZIC1对胃癌发生中MAPK、PI3K和Shh信号通路的分子调控机制。同时采用基因芯片技术对ZIC1下游相关靶基因进行系统筛选,并对关键基因进行验证以明确其对细胞周期和细胞迁移的作用机制。方法和材料：1.将胃癌细胞稳定转染pCDNA3.1和pCDNA3.1-ZIC1载体后,采用MTS及Transwell试验检测ZIC1对胃癌细胞生物学行为(细胞增殖、迁移及侵袭)的影响。2.采用流式细胞仪分析过表达ZIC1后胃癌细胞周期和细胞凋亡的变化,采用Western blot检测细胞周期相关蛋白(p21, p27, cyclinD1)和细胞增殖MAPK、PI3K信号通路关键蛋白(Akt, Erk1/2)的变化。3.通过建立外源性过表达ZIC1胃癌细胞株,探讨其对Shh蛋白表达的影响；进一步利用Cyclopamine阻断Shh信号通路,研究对细胞周期关键蛋白(p21,cyclinD1)的表达及其对胃癌细胞迁移的影响。4.MKN28细胞稳定转染pCDNA3.l空白载体和pCDNA3.1-ZIC1后,分别收集RNA逆转录为cDNA,利用基因表达谱芯片技术检测筛选ZICI可能的下游调控基因,并对其中三个基因CDKN2B, TP53INP1, ARHGAP进行Q-PCR验证。结果：1.过表达ZIC1可抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭。过表达ZIC1后BGC823胃癌细胞增殖在第1天和第3天显著减慢(p<0.001)。过表达ZIC1后AGS,BGC823和SGC7901细胞迁移数量显著减少(p<0.001)；过表达ZIC1后AGS细胞侵袭数量明显下降(p<0.05)。2ZIC1可显著抑制MAPK和Pi3K信号通路,进一步调控了关键细胞周期相关蛋白的表达。外源性过表达ZICI后AGS和SGC7901胃癌细胞在细胞周期G1期DNA的含量增多,而S期DNA含量相应降低。胃癌细胞过表达ZIC1可显著上调细胞周期相关蛋白p21,p27的表达,同时抑制cyclin D1表达。过表达ZIC1后AGS, MKN28.BGC823和SGC7901细胞株的p-Erk1/2和p-Akt活性蛋白表达明显降低,而总蛋白Erk1/2和Akt无明显改变。3ZIC1对胃癌细胞周期蛋白和胃癌细胞迁移的调控可能与抑制Shh信号通路有关。过表达ZIC1后胃癌细胞株SHHmRNA的表达明显下降(p<0.01),Shh蛋白表达水平显著下调。Cyclopamine药物处理抑制Shh信号通路后胃癌细胞ZIC1mRNA表达水平未见明显变化,细胞周期相关蛋白p21表达上调,cyclinD1表达下调。另外,Transwell迁移试验发现Cyclopamine药物处理后胃癌细胞迁移数量显著减少(p<0.001)。4.筛选和验证胃癌细胞ZIC1调控下游候选基因。通过人类全基因组芯片筛选出ZIC1下调下游基因132个,上调基因66个,功能归类分析显示差异基因主要参与细胞周期、细胞增殖、细胞迁移和转录调控等。挑选代表性基因CDKN2B,ARHGAP9,TP53INP1进行Q-PCR验证,结果与芯片检测结果基本相符。结论：1.过表达ZIC1抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为。2.过表达ZIC1显著抑制Akt、Erk1/2磷酸化水平,进一步调控了关键细胞周期相关蛋白p21,p27和cyclin D1的表达,从而调控胃癌细胞周期G1/S检测点。3.过表达ZIC1抑制胃癌细胞Shh的表达水平。通路抑制剂阻断Shh下游分子可以影响胃癌细胞p21和cyclin D1表达,并抑制细胞迁移。ZIC1对胃癌细胞周期蛋白和胃癌细胞迁移的调控可能与抑制Shh信号通路有关。4ZIC1可能通过调控胃癌细胞周期、增殖、迁移和转录调控等相关下游功能基因,从而发挥重要生物学功能。