背景肝癌发病率位居中国常见恶性肿瘤的第五位,而且是肿瘤相关死亡的第三大因素。美国2017年最新癌症统计学报告显示,过去25年来,美国癌症总死亡率下降了 25%,但肝癌死亡率持续上升。肝癌的治疗手段很多,放射治疗作为重要的治疗手段之一。虽然放射治疗在肝癌的治疗中起着重要作用,但在临床治疗过程中也存在不少效果不佳的案例,面临着许多治疗上的困难,例如肿瘤对放射线的耐受,是放疗科医生一直面临的头痛问题。因此,探索肝癌的放疗抗拒机制,提高放疗敏感性,对难治性癌的治疗具有重要意义。研究表明:肝脏肿瘤细胞中存在着异质细胞[11],对放射线如低能射线具有抵抗性,是肿瘤对治疗失效的主要原因。虽有多种恶性肿瘤成功建立获得性放射抗拒细胞株的报道,但就目前而言,对能公认的,具有说服力的模型建立方式并不多。因此,探索肝癌放射抗拒细胞株的建立模式显得尤为迫切。而且,建立肝癌放射抗拒细胞株也可为后续研究提供可靠的细胞平台,为进一步理解肝癌放疗抗拒机制提供基础性工具。根据之前的报道,肿瘤放射抗拒性依赖于有效的DNA损伤修复,低凋亡率,G2期阻滞,肿瘤干性及增殖能力增强。放疗对细胞损伤的靶点在DNA双链,DNA损伤激活的信号通路可产生Y-H2AX,并在照射后1小时表达量达到高峰。S期和G2/M期是细胞DNA以姐妹染色单体为模板进行同源重组的阶段,被认为是细胞进行DNA双链修复的重要时间。Caspase 3,BCL-2,BAX都是凋亡的相关基因,可反映细胞凋亡情况。上皮细胞粘附分子(Epcam)被认为是肝癌干细胞的标志物,可以激活Wnt信号通路,增强成瘤能力,降低凋亡率等特性。SLUG,作为Snail家族的一员,具有高度保守的锌指结构,广泛存在于许多类型的肿瘤中,如鼻咽癌,肝癌,宫颈癌,直肠癌等。SLUG在肿瘤中起着重要的调控作用,SLUG可参与调控多种信号通路,如转化生长因子-β(transforming growth factor,TGF-β)、Smad 蛋白(drosophila mothers against decapentaplegic protein,SMAD)、Notch 通路、PUMA 通路、SCF/c-kit 相关通路、核转录因子-κB(nuclear transcriptionfactor-κB,NF-κB)、缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)等,SLUG 也可调控 OCT4、NANOG、KIF4、L1 细胞粘附分子(L1 cell adhesion molecular,L1CAM)和 CD147 肿瘤相关分子的表达。而核转录因子-κB(nucleartranscriptionfactor-κB,NF-κB)、缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1a)等信号通路参与肿瘤细胞放射敏感性的调控[12]。基因的表观修饰、转录调控及转录后调控被认为是在基因表达调控网中重要的环节。长链非编码RNA(LncRNA)作为继微小RNA(microRNA)之后的又一个明星分子,是一种广泛存在于真核生物中的非编码单链小分子RNA,是重要的转录后调控因子。从染色体修饰、染色体剂量补偿、细胞增殖分化、细胞结构整合、细胞周期调控等方面,在疾病和肿瘤的发生、发展过程中发挥着举足轻重的作用。多项研究己证实了 LncRNA在肿瘤的发生发展起重要作用,但其在肿瘤放射抗拒中的作用机制仍未阐明。因此,利用芯片筛选出来的LncRNAs,将进一步为理解肝癌放射抵抗机制提供理论依据与为临床上药物提供可能新的放射增敏作用靶点[13]。目的1.建立肝癌放射抗拒细胞株(MHCC-97H-R)及确定亚致死剂量,为研究肝癌放疗抗拒机制提供细胞平台;2.MHCC-97H-R细胞株DNA损伤修复能力与修复相关基因表达的观察;3.研究SLUG可以通过影响肿瘤干性来调控肝细胞癌的放疗抵抗性;4.初步确定可能参与肝癌放射抗拒调控的LncRNAs及其参与调控的信号通路。材料及方法1.通过常规剂量分割法(2Gy/F)与亚致死剂量法(2Gy/F,4Gy/F,6Gy/F,8Gy/F,10Gy/F)分别建立肝癌获得放射抗拒细胞株(15次组MHCC-97H,20次组MHCC-97H,25次组MHCC-97H,30次组MHCC-97H),并获得肝癌细胞株(MHCC-97H,QGY-7701)的亚致死剂量,采用平板克隆实验及多靶单击模型分析不同亚组细胞的放射抗拒性。2.测定细胞凋亡率、细胞周期及Epcam的表达情况,用Western-blot、彗星实验及Edu掺入实验评估DNA双链损伤程度及修复能力,实时荧光定量PCR及Western-blot用来检测DNA双链损伤(Y-H2AX)及凋亡相关基因(Caspase 3,BCL-2,BAX)的表达情况。3.经6Gy单次照射后,在不同时间点检测SLUG的表达,和肝癌细胞干性相关基因(SOX-2,OCT-4,KIF-4,NANOG)表达及DNA双链修复相关基因(CHK1,ATM,CHK2,ATR,Y-H2AX)的表达情况。4.肝癌放射抗拒细胞株(MHCC-97H-R)及原始细胞株(MHCC-97H)在经过亚致死剂量(6Gy of 6MV X-ray)照射后1h,收取细胞,加入细胞裂解液(TRIZOL),送往上海康成公司做LNCRNA基因芯片。结果(1)通过常规分割法建立的各亚细胞株,其中2Gy 25次组具有最强的放射抗拒性(平均致死剂量D0=2.612Gy,而原始细胞株D0=1.434Gy),我们命名为MHCC-97H-R,亚致死剂量确定为6Gy。(2)经过单次剂量6Gy照射后24h,相比原始细胞,MHCC-97H-R表现出:1.更低的凋亡率(MHCC-97H细胞株总凋亡率为25.20±6.120713738%,MHCC-97H-R 细胞株总凋亡率 14.47±3.369573662%,);2.明显的G2期阻滞(MHCC-97H细胞株照射后24h,处于S期细胞比率为26.35%,处于G2期细胞比率为49.82%。MHCC-97H-R照射后24h后处于S期细胞比率分别为15.13%,处于G2期细胞比率为63.04(P<0.05))。3.彗星实验显示其出现更短的彗星尾巴(MHCC-97H与MHCC-97H-R细胞 OTM(olive tail moment,尾矩)值分别为 28.94±1.332,5.603±0.51);4.经过单次剂量6Gy照射后24h,EPCAM在MHCC-97H-R的表达量更高(MHCC-97H 细胞中 EPCAM 表达率为 87.48±3.627%,MHCC-97H-R 则是98.49±0.523%)5.EDU掺入实验提示MHCC-97H-R掺入更多的DNA修复原料(MHCC-97H与MHCC-97H-R细胞株掺入5-乙基-2’-脱氧尿苷(EdU)相对荧光强度分别为121.32±39.67、45.22±10.09)。(3)通过转染实验在肝癌细胞株QGY-7701成功敲低SLUG的表达后,通过荧光定量PCR可以观察到当SLUG低表达后,其细胞干性表达(SOX-2,OCT-4,KIF-4,NANOG)随之降低。在给予细胞6Gy后,可观察到在不同的时间点,低表达SLUG的肝癌细胞QGY-7701其放射抗拒性随之下降,表现为低表达SLUG的肝癌细胞QGY-7701的ATM-CHK1,Y-H2AX表达上升,而ATR-CHK2 的表达上调,同时干性表达(SOX-2,OCT-4,KIF-4,NANOG)下降,表明SLUG可能通过调控肿瘤的干性影响其放射抗拒性。(4)基因芯片结果:筛选出695个具有统计学意义的差异LNCRNA(Fold Change≥2,P-value≤0.05),其中313个是上调的,214个是下调的。根据LNCRNAs在基因组上相对于邻近编码蛋白基因转录本的位置,优先筛选具备内含子反义链和自然反义链关系的LNCRNA,MHCC-97H-R与MHCC-97H-R细胞株存在90个上调的LNCRNA,39个下调的LNCRNA。生物信息学分析:(1)GO(Gene Ontology)分析:相比原始的肝癌细胞株MHCC-97H,表达上调的LNCRNAs,有30个参与了细胞死亡的过程,其中有29个参与了细胞凋亡的过程;(2)Pathway分析:相比原始的肝癌细胞株MHCC-97H,表达上调的LNCRNA,有8个LNCRNA可能参与了胞液DNA相关反应通路(Cytosolic DNA-sensing pathway),9 个 LNCRNA 参与了 TNF信号通路(TNF signaling pathway)总结通过“低剂量(2Gy/次)长程诱导”的方法,历时1年,建立具有显著放疗抗拒性的肝癌细胞株(MHCC-97H-R)。并在随后的试验中,验证了其多项放射生物学特性(细胞凋亡,细胞周期,DNA损伤修复能力):X线照射后24h MHCC-97H-R细胞凋亡率下降,G2期阻滞增强,DNA损伤修复能力和其肿瘤干性均显著优于亲本细胞株(MHCC-97H)。以上这些结果可以明确我们所建立的肝癌获得性放射抗拒细胞株(MHCC-97H-R)具有显著的放疗抗拒性。接着我们通过不同实验(蛋白印迹实验,实时荧光定量PCR,转染实验)试图去解释SLUG,肿瘤干性,肿瘤的放疗抗拒性三者之间的关系。研究结果也显示在不同的时间点,肿瘤细胞可以通过SLUG调控肿瘤干性来影响肿瘤细胞的放射抵抗性。为了更深一步了解肿瘤放疗抵抗性的机制,我们送检MHCC-97H与MHCC-97H-R做LNCRNA基因芯片,并用RT-qPCR验证芯片的可靠性,最后筛选结果显示:MHCC-97H-R与 MHCC-97H细胞株存在90个上调的LNCRNA,39个下调的LNCRNA。对其做了 GO分析结果显示:相比原始的肝癌细胞株MHCC-97H,表达上调的LNCRNAS,有30个参与了细胞死亡的过程,其中有29个参与了细胞凋亡的过程。Pathway分析结果显示:相比原始的肝癌细胞株MHCC-97H,表达上调的LNCRNA中,有8个LNCRNA可能参与了胞液 DNA 相关反应通路(Cytosolic DNA-sensing pathway),9 个 LNCRNA可能参与了 TNF 信号通路(TNF signaling pathway)。