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乙酰/丙二酸单酰基转移酶(Acetyl-CoA and malonyl-CoA transacylases, MAT)是脂肪酸合酶基因的一个功能域,是动物体内合成短、中链脂肪酸的关键酶,具有终止FASN基因调控的脂肪酸碳链延长而释放出短、中链脂肪酸的作用。MAT区域的过表达分析有助于山羊奶脂肪酸代谢的调控机理研究。本研究采用RT-PCR技术克隆奶山羊FASN基因MAT区域序列并进行生物信息学分析,利用穿梭载体pAdTrack-CMV和腺病毒骨架载体pAdEasy-1构建了重组腺病毒过表达质粒pAdEasy-MAT-HIS。通过感染奶山羊乳腺上皮细胞研究MAT过表达对脂肪酸代谢相关基因的影响作用,为奶山羊乳腺脂肪酸代谢调控研究提供依据。获得以下主要研究结果:(1)克隆了奶山羊脂肪酸合酶基因乙酰/丙二酸单酰CoA区域,其核苷酸序列为981bp,编码327个氨基酸残基。物理性质分析发现,MAT蛋白分子量为36 KD,其等电点为5.83,N端和C端都表现出较强的疏水性。MAT蛋白含有15个磷酸化位点,包括13个丝氨酸磷酸化位点、1个酪氨酸磷酸化位点和1个苏氨酸磷酸化位点。(2)构建了包含MAT片段的腺病毒穿梭载体pAdTrack/CMV-MAT-HIS,采用同源重组的方式获得重组腺病毒载体pAdEasy-MAT-HIS,并在HEK 293细胞中包装成功,获得高滴度重组腺病毒。病毒滴度为2×109 U/mL。(3)通过梯度接毒的方法(感染病毒量MOI值分别为50,100,150,200,250),感染奶山羊乳腺上皮细胞72h后,观察细胞的荧光状况和细胞形态,得到最佳MOI值为200。Western blotting结果表明,过表达效果显著。实时荧光定量PCR结果显示,过表达组MAT的mRNA水平是对照组的2781倍。(4)实时荧光定量PCR检测结果表明,病毒感染奶山羊乳腺上皮细胞72h后,脂蛋白脂酶基因(LPL)、肝X受体α基因(LXRα)、激素敏感脂酶基因(HSL)、甘油三酯水解酶基因(ATGL)、硬脂酰辅酶A脱氢酶基因(SCD)、心脏细胞型脂肪酸结合蛋白基因(H-FABP)、固醇调控元件结合蛋白-1基因(SREBP-1)、瘦素受体基因(LEPR)、脂肪分化相关蛋白基因(ADRP)、6-磷酸甘露糖受体靶蛋白基因(TIP47)、短链脂肪酸受体GPR41和GPR43基因的mRNA表达量与对照组相比分别降低了76.5%、72.1%、51.0%、12.3%、11.9%、51.4%、54.0%、35.0%、40.8%、69.1%、70.8%和69.6%;脂肪酸合酶基因(FASN)和乙酰CoA羧化酶基因(ACACA)的mRNA表达量分别是空白对照组的10.20倍和1.17倍。综上所述,本研究从西农萨能奶山羊乳腺组织中克隆得到FASN基因MAT区域序列,与NCBI山羊MAT序列具有较高的相似度。用pAdEasy系统构建的腺病毒过表达载体感染奶山羊乳腺上皮细胞后MAT基因的表达量显著上升。