论文部分内容阅读
由于良好的生物相容性、生物降解性、无毒且免疫原性低等优点,胶原在生物材料、再生医学和临床医学等领域被广泛地研究和应用。胶原的生物学活性与其三螺旋分子结构及其自组装形成的D周期性横纹纤维结构密切相关。关于由胶原分子组装形成有横纹结构胶原纤维的机制已取得了丰富的研究成果。但是,在胶原基生物材料的制备中,由于胶原主要由动物组织提取和纯化获得,不可避免的是大量聚集体的存在。胶原聚集体能否组装为有横纹结构的纤维,通过何种过程和机制进行组装,所组装形成的纤维对胶原基生物材料有何影响,对这些问题进行深入研究,将为胶原基生物材料的研究和开发提供新的途径和思路。 本论文深入研究了牛腱来源Ⅰ型胶原聚集体的自组装机制,考察了胶原聚集体组装过程以及相关影响因素;分析了聚集体形成纤维对胶原基材料性能的影响;并进一步根据所获得的研究结果,探讨了胶原聚集体组装机制以及具有抑制胶原聚集体自组装过程的多肽的潜在应用价值。 1.磷酸盐缓冲溶液(PBS)对Ⅰ型胶原聚集体自组装过程的影响 选用Sigma牛腱Ⅰ型胶原制备胶原溶胀液,通过圆二色谱仪(CD)、红外光谱仪(IR)、紫外可见光分光光度仪(UV)以及动态光散射仪(DLS)等手段对胶原溶胀液进行表征,结果显示所用胶原无杂蛋白和核酸的污染;DLS发现胶原溶胀液中胶原以聚集体(aggregates)形式存在;胶原聚集体保持了其典型的三螺旋结构和红外吸收光谱特征。原子力显微镜(AFM)和扫描电子显微镜(SEM)结果显示在玻璃基底上胶原以类球形颗粒均匀分布。在加入PBS条件下,胶原聚集体可以发生自组装,并受离子强度的影响,过程中聚集体不会解聚为单体;通过AFM和SEM观察胶原聚集体在玻璃基底表面的组装过程,发现在加入较低浓度PBS时,仍然可以在PBS滴加区发现有横纹结构的胶原纤维形成,但其覆盖面积较小,随着PBS终浓度的增高,胶原纤维形成数量明显增多,纤维覆盖面积明显扩大;本研究条件下,胶原聚集体纤维形成过程存在着对PBS(离子强度)的浓度梯度依赖。 2.胶原聚集体的自组装过程 通过差示量热法,本研究发现由聚集体组装形成的胶原纤维无明显的变性吸热峰,提示不同于天然胶原纤维,聚集体所形成胶原纤维为非定形态为主,也提示聚集体组装的过程不同于胶原分子的组装过程;DLS和浊度测定结果显示胶原聚集体的自组装过程快速、难以控制,使得进一步地分析其中间体具有极大的挑战。对此,本研究主要通过动态组装的方式进行考察。通过搭建了的小型温度、风速和风向可控的类风洞体系,避免了外界环境的影响,考察胶原聚集体在玻璃基底表面的分布情况,发现引入风力可以使聚集体较为均匀地分布于基底材料表面,这为进一步考察胶原聚集体组装过程中的中间体分析提供了基础。通过AFM和SEM研究得出,胶原聚集体在PBS缓冲液作用下的自组装是一个多步骤过程:在PBS缓冲液的作用下,类球样胶原聚集体颗粒首先发生聚集,形成由颗粒结构组装成的纤维样结构,这可能是胶原聚集体组装为胶原纤维过程中的中间体;随着PBS终浓度的增高,中间体结构逐渐发生了改变,类球形颗粒逐渐转变为棒状结构的颗粒,颗粒结合更趋紧密,并进一步有序排列组装,最后形成D周期横纹结构。 3.特异性多肽在胶原聚集体组装过程中的作用 本研究发现了两种来源于胶原分子序列的多肽分子对于胶原聚集体的组装过程具有特异性抑制作用。通过DLS、浊度检测以及AFM和SEM观察得出,多肽P1(胶原α1链上776-796位氨基酸序列合成短肽,可与α2链羧基端末端肽相结合)和P2(α1链137-153位氨基酸合成短肽)能够抑制胶原聚集体自组装过程的发生,并随P1、P2在胶原溶胀液中浓度的增加,其抑制自组装作用增强。基于以上结果,综合分析认为:由于这些对胶原组装起关键作用的残基序列的氨基酸组成具有较强的疏水性,在胶原聚集体中会发生向内弯曲,使得胶原分子更多的以聚集体形式存在;当加入磷酸盐离子时,这些序列中带正电的氨基酸残基与磷酸根离子相互作用形成盐桥,使特异性残基序列暴露于聚集体表面,随着离子强度的增加,暴露的残基序列增多,并与相邻聚集体的特异性残基序列相互作用引发聚集体颗粒的结构改变,这种结构转变进一步使得更多的关键序列暴露于颗粒表面,聚集体颗粒间的分子间特异性相互作用增强,胶原聚集体发生有序取向排列组装,最后形成具有D周期横纹结构的胶原纤维。显然,这种由聚集体间的相互作用力增强的纤维取向组装方式与胶原分子轴向、侧向微纤维生长方式完全不同,这可能是体外重组胶原基材料易于降解、机械性能差的一个重要的原因。 4.复合P1多肽的胶原基材料的研究 在以聚苯乙烯微粒为marker,通过合成偶联多肽P1的聚苯乙烯颗粒(P1PS),考察其与具有横纹结构的胶原纤维的相互作用过程中,显示P1PS可以与胶原纤维发生特异性的结合。由于P1多肽主要是与胶原α2链的羧基C-末端肽存在特异性作用,这个结果说明通过胶原聚集体组装的胶原纤维仍然有游离α2链的C-末端肽存在。据此,本研究分析认为通过P1多肽与α2链的羧基末端相互作用,可能用于构建一种对P1多肽具有缓释作用的复合材料。应用双末端羧基化的聚乙二醇(PEG),合成了P1-PEG-P1衍生物。在P1-PEG-P1作用下,风干胶原纤维基质材料呈现出纤维互相聚集为捆束状结构。对制备的P1-PEG-P1交联的胶原冻干材料的热稳定性和体外酶降解性能进行研究,发现通过P1-PEG-P1可以一定程度的改善胶原基材料的热稳定性及降解性能。体外细胞实验显示,加入P1-PEG-P1后,P1-PEG-P1复合胶原基材料抑制了细胞的粘附和增殖;这是由于P1-PEG-P1主要是通过非共价键作用与胶原纤维结合,细胞培养过程中被缓慢释放,所释放的P1-PEG-P1抑制了细胞黏附和增殖中起关键作用的细胞外基质成分胶原纤维的形成,进而产生了细胞黏附和增殖抑制的作用。这类材料在引导组织再生、瘢痕增生性疾病等的治疗中具有潜在的应用价值。