研究背景胃癌是全球高发的恶性肿瘤之一。尽管近年来,欧美等发达国家胃癌发病率及死亡率显著降低,然而在我国,胃癌仍是发病率高居第四位的常见恶性肿瘤。现中国胃癌年新发病例数已超过四十万,居全球首位,年化死亡率约为恶性肿瘤患者死亡原因的20%。因此,胃癌仍是严重危害我国居民生命健康的重大疾病。侵袭与转移是恶性肿瘤不同于良性肿瘤的主要生物学特征,也是胃癌患者复发及死亡的主要原因。肿瘤细胞侵袭转移是一个多阶段多步骤的发展过程,可经历早期原位癌的生长,肿瘤血管形成,肿瘤细胞变形脱落侵入基质,进入脉管系统,形成微小癌栓,在继发组织器官定位生长并继续转移扩散等。而在肿瘤细胞侵袭转移的过程中,两方面的改变是必需的,一是肿瘤微环境的改变,如肿瘤周围毛细血管新生(Angiogenesis)及细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)的降解与破坏等；另一个则是肿瘤细胞自身的变化,如肿瘤细胞上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)。肿瘤周围毛细血管新生有别于胚胎时期由早期内皮细胞分化形成新血管的过程,是活体组织在已存在的微血管床上以芽生的方式生出新的以毛细血管为主的血管系统的过程。而肿瘤细胞上皮-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)则是肿瘤上皮细胞在多种诱导因素的作用下,失去极性,获得间充质细胞表型,运动及迁移能力增强,易侵入肿瘤周围脉管系统,并逃脱失巢凋亡而发生远处转移。肿瘤周围血管新生与细胞外基质降解为肿瘤细胞营养供给及侵袭转移提供了微环境条件,而肿瘤细胞EMT则为细胞侵袭转移过程中的变形和运动提供了形态学基础。因此,肿瘤周围新生血管形成和肿瘤细胞EMT在肿瘤侵袭转移过程中至关重要。令人关注的是,近期大量研究指出,microRNA在肿瘤细胞侵袭转移进程中发挥不可忽视的调控作用。MicroRNA(微小RNA, miRNA)是长度约18-25bp的内源性非编码小分子RNA。miRNA经大小约70-90个碱基,具有发夹结构的前体pre-miRNA,经Dicer酶切割加工后成熟,可通过与靶mRNA分子的3’非编码区域(3’UTR)完全(植物中常见)或不完全(动物中常见)互补配对,降解mRNA或抑制其蛋白的翻译,进而参与个体发育、细胞增殖、凋亡及转移等多种生命活动的调控。miRNA以其高度的组织特异性、高敏感性、不易降解和易于检测的特征成为肿瘤早期诊断,预后标志物和分子治疗靶标筛选的热点。尤为重要的是,大量研究证实,单个miRNA可通过与多个mRNA的3’UTR结合,在转录后水平调节多个mRNA编码蛋白的表达,同时单个靶蛋白也可被多个miRNAs共同调控,由此形成复杂而精细的调控网络,发挥多种生物学功能。因此,miRNA在胃癌血管形成以及EMT中的作用引起我们的关注。在本研究中,我们发现hsa-miR-506-3p在高侵袭胃癌细胞株中低表达,且低表达hsa-miR-506-3p的胃癌患者预后较差,提示hsa-miR-506-3p具有作为评估胃癌预后的生物标记物的潜能。更为重要的是,差异表达hsa-miR-506-3p可显著改变胃癌细胞诱导血管形成的能力及胃癌细胞侵袭转移。进一步利用在线数据库Targetscan预测分析,我们研究发现：MAP激酶(Mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路中的两个关键分子：胞外信号调节激酶2(Extracellular signal-regulated kinase 2, ERK-2)及其下游转录因子ETS-1的mRNA的3’UTR区同时存在hsa-miR-506-3p的结合位点,提示,hsa-miR-506-3p可能靶向作用于ERK-2/ETS-1信号轴,进而抑制其下游相关功能信号转导,在胃癌细胞微环境血管形成及侵袭转移过程中发挥重要的调节作用。值得关注的是,作为与细胞生长关系最为密切的信号转导通路,MAPK通路参与了包含肿瘤细胞在内的多种细胞的病理生理过程的调控,如细胞生长、发育、运动和凋亡等。MAPK是一个庞大的激酶家族,现已知其亚家族成员至少有6个,如ERK、JNK和P38等。其中,胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)是MAPK家族中最为重要的成员之一,是发现于80年代末期的一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。ERK蛋白主要定位于胞浆,是细胞内丝裂原信号传递的关键信号转导蛋白。ERK的活化需一类双向激酶的激活,即其本身的丝氨酸／苏氨酸和酪氨酸同时磷酸化,激活ERK的激酶即MEK(MAPK/ERK kinase, MAPK/ERK激酶)。ERK被激活后,立即发生核移位,继而活化下游信号分子,如转录因子ETS家族蛋白的活性,从而产生相应的生物学效应。ERK-1和ERK-2是ERK家族最为关键的肿瘤细胞生物学行为调节分子。ERK-1与ERK-2具有相似的结构与功能,常以ERK-1/2并称。令人感兴趣的是,新近研究表明,尽管ERK-1与ERK-2具有高度的同源性,但二者的结构与功能仍具有一定的差异。研究显示,ERK-2而非ERK-1参与肿瘤细胞EMT相关过程的调控。ETS-1是ERK-2下游关键的转录因子之一,是最早发现的高度保守的ETS家族成员。ETS-1在处于血管发育期间的分化或迁移的内皮细胞、神经嵴细胞和侵袭性肿瘤细胞中表达丰富,参与血管内皮细胞迁移能力的调控。并且,在高表达ETS-1的肿瘤组织中,肿瘤微血管密度显著增加,提示ETS-1是肿瘤新生血管形成的重要调节因素。深入研究显示,ETS-1可在转录水平调控血管内皮生长因子受体VEGFR的表达,进而调节VEGFR介导的血管内皮细胞的增殖、募集以及血管通透性等。因此,ETS-1是血管内皮细胞生长、迁移的关键调控因子。另一方面,在肿瘤细胞血管新生及侵袭转移过程中,细胞外基质(Extracellular ma-trix, ECM)的降解与破坏,是肿瘤细胞侵入脉管系统的必要条件,基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase, MMP)在其过程中发挥关键性作用。研究显示,当新的毛细血管网围成环状及新合成的细胞外基质成分沉积、铺垫后,血管环前段新合成的基膜就开始了MMPs所介导的蛋白水解过程,内皮细胞迁徙将开始于局部水解,形成一个新的毛细血管芽,随后又经历了一系列细胞外蛋白水解酶的活化与抑制的动态循环。现已知的基质金属蛋白酶家族包括26种蛋白亚型,编号MMP1～MMP29。其中,MMP-9为MMP家族的最为重要的成员之一,由结缔组织细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞等以前酶原形式表达和分泌,其氨基酸序列具有活性前区、催化基团、与细胞外基质同源序列区域和C-末端区,转录调节是MMP-9表达最主要的调节方式。新近研究发现,MMP-9启动子区存在ETS-1结合位点,提示ETS-1参与MMP-9转录调控。更为重要的是,MMP-9介导的细胞外基质降解不仅可以促进肿瘤血管形成,还可通过分解和释放生物活化分子刺激肿瘤细胞浸润,妨碍免疫监视,诱导肿瘤细胞侵袭转移相关过程。MMP-9可通过降解细胞外间质和基底膜而促进肿瘤周围血管形成,同时促进肿瘤侵袭和转移。以上研究提示：ETS-1/MMP-9在肿瘤血管形成和细胞EMT过程中发挥至关重要的作用。综合上述研究进展,我们推测,ERK-2/ETS-1/MMP-9相关信号通路在肿瘤血管形成及肿瘤细胞侵袭转移过程中具有重要的调控作用。因此,靶向抑制ERK-2与ETS-1是抑制肿瘤细胞侵袭转移的关键措施。如前所述,miRNA具有高度的组织特异性和敏感性,且不易降解和易于检测,是肿瘤标志物与靶向治疗的最佳候选分子,重要的是,单个miRNA可同时与多个靶mRNA的3’UTR区结合,在转录后水平调节多种靶蛋白的表达,全面地调控肿瘤细胞生物学功能。因此,同时靶向ERK-2和ETS-1的miRNA引起我们的关注。利用在线数据库Targetscan预测分析,我们研究发现：胞外信号调节激酶2(ERK-2)及其下游转录因子ETS-1的mRNA的3’UTR区均存在hsa-miR-506-3p的结合位点,提示,hsa-miR-506-3p可能靶向作用于ERK-2/ETS-1信号轴,更大程度地调节其下游相关功能信号转导。更为重要的是,hsa-miR-506-3p在晚期胃癌患者组织中低表达,提示hsa-miR-506-3p具有作为评估胃癌预后的生物标记物的潜能。因此我们推测hsa-miR-506-3p可能通过靶向作用于ERK-2/ETS-1相关信号转导通路,抑制MMP-9的表达,进而调控胃癌周围血管形成以及肿瘤细胞EMT,在胃癌细胞的侵袭转移过程中发挥重要的调节作用。研究目的1、在临床组织水平,以良性胃肿瘤病变组织远端正常组织为对照,探究hsa-miR-506-3p在各期临床胃癌患者组织样本中的表达情况及与患者预后的关系,为研究hsa-miR-506-3p在胃癌中的作用机制提供临床证据；2、在细胞水平明确hsa-miR-506-3p在胃癌周围血管新生及肿瘤细胞EMT中的生物学功能,为进一步探讨hsa-miR-506在胃癌中的作用及机制提供实验依据；3、分析并验证hsa-miR-506-3p下游直接作用靶点,探讨hsa-miR-506-3p在胃癌侵袭转移中的作用机制。方法与结果第一章Hsa-miR-506-3p在晚期胃癌患者中表达降低且与患者预后显著相关方法1、收集胃腺癌组织标本及良性胃肿瘤远端10cm以外的正常胃组织样本。因胃癌组织学分型复杂,WHO(2000年)分类法将其分为：腺癌(肠型和弥漫型)、乳头状腺癌、管状腺癌、粘膜腺癌、印戒细胞癌、腺鳞癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、未分化癌和其他,其中,腺癌是胃癌最常见的病理组织类型。因此,我们选择胃腺癌患者为研究对象。2、利用Real-time PCR技术,对比检测hsa-miR-506-3p在正常胃组织及各期胃癌患者组织中的表达情况,并统计分析各组表达差异。3、结合亚组分析及生存期随访,在临床水平上验证hsa-miR-506-3p在胃癌分期及患者预后中的作用。4、利用Real-time PCR检测hsa-miR-506-3p在7株胃癌细胞系(BGC-823、 AGS、HGC-27、KatoⅢ、SGC-7901、MKN45及MGC-803)中的基础表达量,并检测各细胞系基本侵袭能力,以选择细胞进行后续生物学功能实验。结果1、为了检测hsa-miR-506-3p在临床各期胃腺癌患者中的表达水平,我们利用Real-time PCR技术对109例胃癌组织标本中hsa-miR-506-3p的表达情况进行检查,以8例良性胃部病变的远端正常组织标本为对照,以U6为内参,检测发现,hsa-miR-506-3p在胃癌组织中的表达显著低于胃正常组织,差异具有统计学意义(p<0.001)。2、结合临床亚组统计分析发现,hsa-miR-506-3p在胃癌组织中的表达情况随着患者AJCC临床分期的进展逐步降低,且差异具有显著性(p<0.001),同时,hsa-miR-506-3p的表达同胃癌患者TNM分期中T分期(p=0.041)及N分期(p=0.024)显著相关,提示hsa-miR-506-3p可能参与胃癌的恶性进展与淋巴结转移的调控。3、更为重要的是,生存期随访结果显示,hsa-miR-506-3p高表达(hsa-miR-506-3p表达量高于均值)的胃癌患者生存期显著优于hsa-miR-506-3p低表达(hsa-miR-506-3p表达量高于均值)的患者,差异具有统计学意义(p<0.05),提示hsa-miR-506-3p是评价胃腺癌患者预后的候选分子标志物。4、Hsa-miR-506-3p在胃癌细胞系BGC-823、AGS、HGC-27、KatoⅢ、SGC-7901、MKN45及MGC-803中表达均显著低于正常胃组织细胞(p<0.001),且与细胞侵袭能力密切相关。Hsa-miR-506-3p在BGC-823细胞中相对高表达,在SGC-7901细胞中相对低表达,因此选择BGC-823细胞进行hsa-miR-506-3p敲减功能实验,选择SGC-7901细胞进行Hsa-miR-506-3p过表达功能实验。第二章Hsa-miR-506-3p抑制胃癌细胞周围血管新生及胃癌细胞侵袭转移方法1、利用hsa-miR-506-3p mimics质粒,转染低表达hsa-miR-506-3p的胃腺癌细胞SGC-7901；利用hsa-miR-506-3p inhibitor质粒,转染高表达hsa-miR-506-3p的胃腺癌细胞BGC-823。2、通过鸡胚尿囊绒毛膜血管形成实验及体外小管形成试验研究hsa-miR-506-3p在肿瘤血管新生中的作用。3、明胶酶谱法分别检测过表达或抑制hsa-miR-506-3p后,胃癌细胞中,基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达情况。4、利用Boyden侵袭实验,划痕实验及3D细胞培养技术,探究hsa-miR-506-3p对胃癌细胞中的侵袭转移能力,及伪足形成能力等的作用。5、Western blot法分别检测过表达或抑制hsa-miR-506-3p后,胃癌细胞中上皮相关标记蛋白E-cadherin、α-catenin,以及间质标记蛋白N-cadherin、Vimentin表达情况。结果1、在相对低表达hsa-miR-506-3p的胃腺癌细胞SGC-7901中,导入hsa-miR-506-3p mimics质粒,建立过表达hsa-miR-506-3p的瞬转细胞(SGC-7901-miR506OE);在相对高表达hsa-miR-506-3p的胃腺癌细胞中BGC-823中,转染hsa-miR-506 inhibitor质粒,建立低表达hsa-miR-506-3p的瞬转细胞(BGC-823-miR506KD).2、肿瘤周围血管形成是肿瘤细胞恶性进展重要的微环境基础,通过鸡胚尿囊绒毛膜血管形成实验及体外小管形成实验发现,导入hsa-miR-506-3p后,胃腺癌细胞SGC-7901-miR506OE在鸡胚尿囊绒毛膜中诱导新生血管量显著减少,且诱导内皮细胞成管率显著降低,差异具有统计学意义(p<0.001)；敲减hsa-miR-506-3p的胃腺癌细胞BGC-823-miR506KD在鸡胚尿囊绒毛膜中诱导新生血管量增加,且诱导内皮细胞成管率显著提高,差异具有统计学意义(p<0.001)。提示,内源性hsa-miR-506-3p可抑制胃腺癌细胞诱导的周围血管新生。3、通过明胶酶谱法检测发现,过表达hsa-miR-506-3p后,胃腺癌细胞SGC-7901-miR506OE中,基质金属蛋白酶MMP2、MMP9的表达量降低；而抑制hsa-miR-506-3p后,胃癌细胞BGC-823-miR506KD中,基质金属蛋白酶MMP2、 MMP9的升高,提示hsa-miR-506-3p可通过抑制MMP2与MMP9蛋白活性参与肿瘤细胞微环境的调节。4、通过Boyden侵袭实验,划痕实验及3D细胞培养技术实验发现,导入hsa-miR-506-3p的胃腺癌细胞SGC-7901-miR506OE伪足形成率显著降低,细胞侵袭及转移能力显著下降,差异具有统计学意义(p<0.001)；而敲减hsa-miR-506-3p的胃腺癌细胞BGC-823-miR506KD,细胞伪足形成率显著提高,侵袭转移能力增强,差异具有统计学意义(p<0.001)。5、通过Western blot检测发现,过表达hsa-miR-506-3p后,胃癌细胞SGC-7901-miR506OE中,上皮相关标记蛋白E-cadherin、α-catenin表达上调,间质标记蛋白N-cadherin、Vimentin表达下调；而抑制hsa-miR-506-3p表达后,胃癌细胞BGC-823-miR506KD中,上皮相关标记蛋白E-cadhern、α-catenin表达降低,间质标记蛋白N-cadherin、Vimentin表达升高。提示,hsa-miR-506-3p可通过抑制肿瘤细胞EMT,抑制细胞侵袭与转移。第三章Hsa-miR-506-3p靶向调节ERK-2/ETS-1相关信号转导抑制胃癌细胞侵袭与转移方法1、利用Targetscan数据库(http://www.targetscan.org, last accessed May 20, 2015)分析,结合功能学实验,寻找hsa-miR-506-3p作用靶点及相关信号通路。2、利用荧光素酶报道基因系统、Western blot进一步检测hsa-miR-506-3p调控的靶基因及相关信息通路。3、利用免疫组织化学及临床参数分析,检测hsa-miR-506-3p下游关键靶基因ETS-1在胃癌组织中的表达情况及与临床各参数间的相关性,并进一步探讨ETS-1与MMP9在胃癌临床病理样本中表达的相关性。结果1、利用Targetscan数据库预测分析,MAPK通路中的关键信号转导蛋白ERK-2及其下游转录因子ETS-1的mRNA的3’UTR区均存在hsa-miR-506-3p结合位点。2、Western blot验证发现,敲减hsa-miR-506-3p后,胃腺癌细胞BGC-823-miR506KD中ERK-2及ETS-1表达均上调,而导入hsa-miR-506-3p,胃腺癌细胞SGC-7901-miR506OE中ERK-2及ETS-1表达降低。3.荧光素酶活性检测发现,在胃腺癌细胞BGC-823中,利用inhibitor抑制hsa-miR-506-3p表达,ERK-2与ETS-1的3’UTR区荧光素酶的活性显著增强,差异具有统计学意义(P<0.05)；在胃腺癌细胞SGC-7901中导入hsa-miR-506-3p mimics后,ERK-2与ETS-1的3’UTR区荧光素酶的活性同阴性对照组相比显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05)；更重要的是,将hsa-miR-506-3p与ERK-2与ETS-1的3’UTR区结合位点进行突变,即导入hsa-miR-506-3p mut后,ERK-2与ETS-1的3’UTR区荧光素酶的活性与阴性对照均无显著差异(P>0.05)。以上数据提示,hsa-miR-506-3p与ERK-2和ETS-1的3’UTR区均存在特异性结合。4、因ETS-1为已知的ERK-2下游信号因子,且与ERK-2同为hsa-miR-506-3p的功能靶点,因此,其在胃癌组织中的表达情况引起我们的关注。同时,前期研究表明,基质金属蛋白酶MMP9为ETS-1的靶基因,因此,ETS-1及MMP9在胃癌组织中的表达情况及其相关性同样值得探究。利用免疫组织化学检测方法,通过对173例胃癌组织标本检测发现,ETS-1在胃癌组织中的广泛高表达,阳性率为71.10%。结合统计学分析发现,在胃癌组织中ETS-1的表达与MMP9的具有高度的相关性(r=0.459,P<0.001),提示,在胃癌组织中ETS-1可能通过调节MMP9促进胃癌细胞侵袭转移。结论1.Hsa-miR-506-3p可作为候选生物标记物,预测胃腺癌患者预后。2.Hsa-miR-506-3p可通过靶向调控ERK-2及ETS-1相关信号转导通路,抑制基质金属蛋白酶MMP9的表达,抑制胃癌肿瘤新生血管形成及胃癌细胞EMT,进而抑制胃癌细胞的侵袭与转移。