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目的：寄生性杂草列当在新疆广泛存在，对当地加工番茄、甜瓜、西瓜、向日葵等重要经济作物均造成了严重损失。为了有效防治列当危害，本研究对列当种子萌发刺激物独脚金内酯合成相关基因类胡萝卜素裂解双加氧酶基因片段进行克隆、表达及功能验证来明确其在列当与寄主之间相互识别过程中所起的作用。进而再利用RNA沉默技术来研究其对番茄独脚金内酯产生的影响，为培育抗列当品种做好技术储备。 方法：根据根据 Genbank中已经报道的番茄类胡萝卜素裂解双加氧酶7（CCD7）和类胡萝卜素裂解双加氧酶8（CCD8）基因序列信息，设计特异性引物克隆番茄CCD7和CCD8目的基因片段。采用RNAi技术，设计对番茄CCD7和CCD8基因特异性的RNA沉默载体，通过农杆菌介导转化法将其转入番茄中，建立番茄遗传转化体系。收集不同沉默的番茄植株根系分泌物，采用高效液相色谱质谱法（HPLC-MS）分离、纯化，测定独脚金内酯的含量及其对列当种子萌发的影响，验证CCD7和CCD8基因在独脚金内酯合成中的功能。 结果：1、利用Trzol法从番茄根系中提取总RNA，将其反转录成cDNA。根据 GenBank公布的番茄CCD7和CCD8基因系列设计引物7-F、7-R和8-F、8-R，以cDNA为模板，进行PCR反应，分别扩增出大小为400bp的CCD7和CCD8基因片段。经菌液PCR和测序鉴定，测序后与模板序列比对结果显示相似度>90％。系统发育树分析结果显示，克隆得到的基因序列分别与 Solanum lycopersicum的CCD7、CCD8聚在同一个分支上，同源性非常高，表明克隆得到的目的片段序列正确。 2、通过StuⅠ和SalⅠ双酶切pMD18-T-7和pMD18-T-8质粒，将CCD7和CCD8基因片段进行拼接，连接转化后提取质粒，用限制性内切酶XbaⅠ和SalⅠ双酶切pMD18-T-7+8，获得大小为800bp的串联片段CCD7+8。选用pUCCRNAi为中间载体，利用酶切方式将串联片段CCD7+8插入到中间载体上，构建含有Intro在内的反向重复序列结构，最后将其连入植物表达载体p35中，将连接体系转化大肠杆菌菌株 DH5α。提取抗性菌落的质粒，用PstⅠ酶切质粒检测，结果表明，成功构建了含CCD7和CCD8基因片段的RNA沉默载体p35-7+8（FR）。 3、通过电击转化法，将植物表达载体p35-7+8（FR）导入到农杆菌LBA4404中，由PCR检测表明p35-7+8（FR）/LBA4404转化成功。利用重组的农杆菌系统为介导，采用叶盘法将植物表达载体p35-7+8（FR）导入番茄，建立番茄遗传转化再生体系。通过PCR和Southern blot对通过遗传转化得到78株转p35-7+8（FR）基因再生植株基因组 DNA进行检测。检测结果表明：有32株再生植株扩增出大小为400p的目标条带，与阳性对照扩增出的条带位置相同，初步说明目的基因已整合到番茄基因组 DNA中。随机选取3株PCR反应呈阳性的转基因番茄和非转基因番茄植株，分别用它们的PCR产物进行Southern blot杂交，结果发现各有2株转基因植株针对这两个基因都出现了杂交信号。实验结果说明两个基因都已经整合进番茄的基因组。 4、本研究通过大量实验筛选得出：最佳种子灭菌处理方式为：75%酒精30s+0.1%升汞1min+无菌水冲洗3次；最佳不定芽诱导培养基为：MS+6-BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+Cef300 mg/L+Kan50mg/L。无菌苗培养基为：1/2MS；预、共培养基为：MS+6-BA0.2mg/L和MS+6-BA0.2mg/L+Cef300 mg/L+Kan50mg/L；生根培养基为：MS+IAA0.2mg/L。 5、通过水培，用活性碳的方法收集了野生型番茄和转基因番茄根系分泌物，利用乙酸乙酯对其进行萃取，得到根系分泌物的粗提物。将根系分泌粗提物配制成1、1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6mg/mL的溶液，对预培养好的列当种子进行萌发试验。结果显示，列当种子萌发率随着根系分泌物溶液浓度的增加先升高在降低，野生型、rnai-7和rnai-8都在1×10-1mg/mL时达到最大值，萌发率为分别是58.89%、27.64%和24.44%，转基因番茄根系分泌物对列当种子的萌发率显著低于野生番茄对列当种子的刺激作用。以萃取纯化的番茄根系分泌物为材料，利用HPLC-MS，对5-deoxystrigol进行检测。结果发现，标样在保留时间2.98min左右时出现了一个单一清晰的峰，但待检测的番茄根系分泌物样品在相近的保留时间内没有出峰，检测不到5-deoxystrigol的存在。