牙髓炎与牙周炎是临床常见的口腔感染性疾病,口腔内致病菌是其发生发展的重要致病因素^[1,2]。齿垢密螺旋体（Treponema denticola,T.d）在感染牙周及感染根管中具有高检出率,被认为是牙周炎及牙髓炎的重要致病菌^[3],其致病机制方面的研究一直是学者们研究的热点,但由于其致病因子的多样性,相关的致病机理及控制策略仍需要大量的研究与探索。在生物体内,蛋白水解复合体可对需要被降解的蛋白质进行清除,进而控制细胞内蛋白质质量^[4]。Clp（Cleaves peptides protein）蛋白水解复合体是存在于分支杆菌、枯草杆菌及相关菌株体内相似的蛋白酶系统^[4,5],是目前微生物学科研究热点。在Clp蛋白酶研究比较深入的枯草杆菌中,McsB是最早发现的作用于精氨酸残基的蛋白激酶^[6]。McsB作为精氨酸激酶催化需要降解的蛋白质进行磷酸化反应,为蛋白质标记磷酸化标签,同时激活Clp蛋白酶系统^[7]。但目前T.denticola中的精氨酸激酶尚未被分离与鉴定,其在细菌细胞内发挥的功能作用也尚不清楚。本课题组前期研究对Clp C共同转录的TDE2037基因进行了同源搜索,发现其可预测蛋白结构与海洋生物海葵中发现的精氨酸激酶4rf6.2.A蛋白结构相似^[8]。为了探究TDE2037蛋白在T.denticola中的性质与功能,本实验设计构建TDE2037基因的原核表达质粒,诱导表达并纯化目的蛋白,制备针对该蛋白的抗体,为蛋白质质谱分析奠定基础。随后构建T.denticola TDE2037基因突变菌株,对其表型变化进行观察,为探究TDE2037蛋白在齿垢密螺旋体中的功能提供研究方向。第一部分T.denticola TDE2037的原核表达与纯化研究目的1、T.denticola TDE2037融合蛋白表达载体的建立;2、T.denticola TDE2037融合蛋白的表达与纯化;3、T.denticola TDE2037蛋白性质探究。研究方法1、实验室储存菌株T.denticola ATCC 35405进行复苏培养^[9],提取基因组DNA;2、扩增并克隆目的基因TDE2037,正确选择载体质粒,构建TDE2037融合蛋白表达载体质粒;3、使用IPTG对TDE2037融合蛋白进行诱导表达,将细菌细胞破碎离心后借助GE公司AKTAprime ^TMM PLUS蛋白纯化仪对融合蛋白进行纯化和收集[10];4、TDE2037融合蛋白质谱鉴定与分析。研究结果1、菌株T.denticola ATCC 35405基因组DNA提取成功,目的基因TDE2037扩增条带大小与预期相符;2、TDE2037基因分别插入pET-21a与pET2-8a-SUMO原核表达载体质粒中,质粒构建后经测序验证插入的TDE2037基因序列正确,原核表达载体构建成功;3、pET-21a-TDE2037与p ET-28a-TDE2037-SUMO原核表达载体在融合蛋白表达过程中蛋白可溶性不同,p ET-21a-TDE2037在表达纯化过程中形成包涵体,而pET28a-TDE2037-SUMO融合蛋白可溶性明显高于pET-21a-TDE2037;4、原核表达载体pET-28a-TDE2037-SUMO表达的融合蛋白纯化后,经质谱鉴定融合蛋白表达源自T.denticola TDE-2037基因,与精氨酸激酶高度相似。结论根据TDE2037基因序列,成功构建了TDE2037基因原核表达系统,并引入了SUMO标签对其原核表达条件进行了优化,成功实现了重组蛋白的可溶性表达,蛋白质质谱技术检测结果显示纯化得到的TDE2037蛋白与精氨酸激酶具有极高的相似性。第二部分研究目的1、构建T.denticola TDE2037基因敲除及回补质粒;2、构建T.denticola TDE2037基因敲除及回补菌株;3、初步探究TDE2037基因敲除后T.denticola生长以及毒力变化。研究方法1、根据设计并合成的引物,使用聚合酶链式反应扩增TDE2037基因的侧翼序列以及用于敲除基因替换的抗生素基因片段,并引入酶切位点,将基因片段整合插入载体质粒中构建TDE2037基因敲除与回补质粒;2、借助DNA转化技术,将含有外源目的基因和侧翼同源序列的DNA片段转化进细胞中,运用同源重组原理对TDE2037基因进行敲除及回补^[11];3、TDE2037基因敲除菌株构建成功后,将菌株转接培养,观察其生长趋势、性状以及毒力变化。研究结果1、经测序鉴定,T.denticola TDE2037基因敲除质粒与TDE2037基因回补质粒构建成功;2、经鉴定T.denticola TDE2037基因敲除菌株与TDE2037基因回补菌株构建成功;3、TDE2037基因突变株细菌菌落小于野生型,且细菌生长速度慢于野生型,并无法到达野生型细菌的最终菌株密度。借助果蝇动物模型进行TDE2037突变菌株的毒力检测,结果显示当T.denticola菌株缺乏TDE2037基因时,在饥饿条件下使用同样浓度细菌喂食果蝇时,突变菌株实验组果蝇生存率高于野生型菌株。结论T.denticola菌株敲除TDE2037基因时,细菌生长速度以及平台期细菌浓度较野生型菌株低。我们推测T.denticola细胞内缺乏精氨酸激酶时,无法高效诱导Clp蛋白水解系统启动,从而导致细胞内堆积无法水解的蛋白质,最终改变细菌生长状态,细菌生长速度降低。本研究借助果蝇动物模型检测TDE2037突变菌株的毒力变化,在饥饿应激状态下TDE2037突变菌株喂食果蝇的生存率高于野生型细菌喂养果蝇的生存率,与预期实验研究结果一致,我们推测精氨酸激酶缺失会对细菌毒力产生影响。